上海巴玖講解實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為2種：熒光染料和熒光探針。熒光染料法是指SYBR Green I法，熒光探針法包括Taqman探針法、LightCycler法和分子信標（Molecularbeacon）法。

SYBR Green I法是在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。擴增產(chǎn)物序列特異性通過反應(yīng)后變性分析來確證。在反應(yīng)的后階段，反應(yīng)體系的溫度逐漸升高，雙鏈DNA慢慢地變成單鏈，從而SYBR Green I染料釋放出來，導(dǎo)致熒光強度的慢慢降低，測定整個過程的熒光強度，可以獲得PCR產(chǎn)物的變性溫度，因為每一種PCR產(chǎn)物都有不同的長度和GC百分比，所以也具有特征性的變性溫度。通過變性曲線得到的產(chǎn)物大小可以和PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果相比較。這種方法在檢測禽肉中的沙門氏菌和干凍食品中的細菌活性方面已有報道。

Taqman探針法是利用Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸酶活性來酶切和降解標記報告熒光基團和淬滅熒光基團的探針，所以稱為Taqman探針。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，Taq酶的5'→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。PCR擴增產(chǎn)物的指數(shù)增加和熒光強度的增加是相對應(yīng)的。這個系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)商品化，TagMan系統(tǒng)已經(jīng)被用來檢測食物或者純培養(yǎng)物中的單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌0157: H7和沙門氏菌。

分子信標探針是一種具有莖和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈核酸分子，探針分子中環(huán)狀部分的序列和靶核酸的主要已知序列互補，莖部是通過探針序列任何一側(cè)的2個互補臂序列退火形成。臂序列和靶序列沒有關(guān)系，一個熒光基團貼附在一個臂的終端，一個非熒光基團貼附在另一個臂的終端。莖部使得這2個基團緊緊地貼在一起。從而使得熒光團釋放出來的熒光被FRET淬滅。熒光團一淬滅對的原理是熒光團接收到的熒光轉(zhuǎn)移到淬滅物上，消散為熱而不是光，結(jié)果熒光團不能釋放熒光。但是當探針遇到靶分子時，形成的雜交物比通過臂序列形成的雜交物長并且穩(wěn)定，因為核酸的二級螺旋結(jié)構(gòu)相對堅硬，探針和靶序列的雜交就排除了同時存在臂序列雜交的可能。這樣，探針就經(jīng)過自然結(jié)構(gòu)的改變而使臂序列分開，進而使熒光團和淬滅物相互分離。因為熒光團和淬滅物不再緊密地連接在一起，所以在紫外線燈照射下能夠產(chǎn)生熒光。這種方法對致病性反轉(zhuǎn)錄病毒的檢測、沙門氏菌和大腸埃希氏菌0157的檢測都有應(yīng)用。

核酸雜交法

核酸雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的基本技術(shù)方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可以按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方分別是待測核酸序列及探針。用于檢測的已知核酸片段稱之為探針（probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以便于隨后的檢測。常用的標記物是放射性核素、半抗原（digaoxigenin)，生物素(biotin)，辣根過氧化物酶(HRP)，還可以標記一些熒光物質(zhì)如異硫氰酸熒光素（FITC),花青（cyanine, Cy2, Cy3, Cy5）等。

核酸雜交中經(jīng)常使用的是印跡雜交技術(shù)。印跡雜交技術(shù)是指將帶檢測的核酸分子結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。其操作基本流程是：首先用凝膠電泳將待測核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上，轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變。再用標記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交。后洗去未雜交的游離探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記的探針的位置。由于探針已與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少，則反映出待測核酸分子中是否存在相應(yīng)的基因序列及其量與大小。