選擇合適的定量PCR儀方法

定量PCR儀主要由兩部分組成，一個是PCR系統(tǒng)，一個是熒光檢測系統(tǒng)。選擇定量PCR儀的關鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標準品之間的對比來實現(xiàn)定量的，對于定量PCR系統(tǒng)來說，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級放大。至于熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當今的主流趨勢——儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬；多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，儀器就可以同時檢測單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強大。熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實現(xiàn)不同激發(fā)波長，而單色發(fā)光二極管LED價格低、能耗少、壽命長，不過因為是單色，需要不同的LED才能更好地實現(xiàn)不同激發(fā)波長。監(jiān)測系統(tǒng)有*低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，需要通過逐個掃描實現(xiàn)多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟件設計，這一點目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。——隨著定量PCR技術在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測、腫瘤研究等領域的越來越廣泛的應用，市面上不同品牌和設計的定量PCR儀也不斷推陳出新。

1. 傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀
傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進行批量的定量反應，但是缺點也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應——樣品槽上每個孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應（可參考生物通龍虎榜：PCR儀的選擇一文），因此標準曲線的反應條件應難以做到與樣本*一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對于靈敏度的定量PCR來說，任何極微小的差異都會以指數(shù)級別的規(guī)模被放大，不能不說是一種缺憾。傳統(tǒng)反應板面積大，溫度控制的性、升降溫速度也相對較慢，因而反應速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個樣品孔距離光源和監(jiān)測器的光程各不相同，有可能對結果產(chǎn)生影響。檢測在試管管底進行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對結果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。

ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時激發(fā)96個樣品，*低溫CCD具備同時多點多色檢測的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等熒光染料。多色熒光檢測技術為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎。多重定量即在同一反應管內(nèi)同時對多個目標基因進行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件Primer Express非常有用，“因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設計定量PCR所需的TaqMan探針”。 各型號都有實時動態(tài)(Real-Time)和終點讀板(Plate Read)兩種運行模式。實時動態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)?？梢詣討B(tài)顯示PCR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等。當然，也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀的優(yōu)勢在于ABI已經(jīng)發(fā)布十二萬種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因，二百萬種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測試劑盒，為運用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創(chuàng)造了的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴增反應是否特異，有無雜帶生成。7500型號比7300多一個濾光鏡，新的光路設計使長波長紅色熒光的檢測靈敏度大大提高，帶有快速運行模式。增強的7900型在96孔模塊的基礎上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數(shù)據(jù)的能力大大增強，應該更適合經(jīng)常處理大量標本的實驗室。

MJ的Option系列是在MJ原來的常規(guī)PCR儀基礎上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒光檢測器。 96個單色LED光源對應96孔板，但是單色LED激發(fā)波長范圍較窄。Option是單道單個光電倍增管熒光檢測器，升級的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，所以Option系列是逐孔掃描而非同時檢測96個樣品。雙PMT可同時進行雙色檢測(FAM/SYBR Green I；VIC/Joe/TAMRA)。優(yōu)勢之一是帶梯度功能。Bio-Rad(伯樂)也算是個熟悉的品牌，iCycler iQ實時定量PCR系統(tǒng)也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測波長范圍400-700nm，可4波長同時檢測，儀器的設計靈活，定性和定量部分可獨立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測波長。技術intensifier熒光放大器保證了的檢測靈敏度。MJ被Bio-Rad收購后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來Bio-Rad會如何決定二者的發(fā)展方向還需要拭目以待。

2.創(chuàng)新概念的離心式實時定量pcr儀
為了克服平板式定量pcr溫度均一性差的缺點，聰明的研究人員又開發(fā)出創(chuàng)新概念的離心式實時定量pcr儀，以roche羅氏的lightcycle和corbett的rotor-gene為代表。pcr擴增樣品槽被巧妙地設計為離心轉子的模樣，借助空氣加熱和轉子在腔內(nèi)旋轉，轉子上每個孔都是“等位”的，幾乎無差別，很好的解決了每個樣品孔之間的溫度均一性的關鍵問題——corbett的rotor-gene樣品間溫度差異小于±0.01℃地保障了標準曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質(zhì)的優(yōu)點在于能實現(xiàn)與反應體系無縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競爭對手批評空氣介質(zhì)比熱小，但事實上roche的lightcycle%202.0卻是目前升溫速度快的定量pcr儀，可以達到20℃/秒！Corbett的Rotor-gene也可以達到5℃/秒(樣品實際升溫速度達到2.5℃/秒)，優(yōu)于多數(shù)的平板式PCR儀。借助旋轉離心力還可以隨時將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無需熱蓋；還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應體系混合，實現(xiàn)“機械的熱啟動功能”。由于升溫速度快，對于常規(guī)需要2個多小時完成的定量PCR反應，Roche的LightCycler僅需20—30分鐘即可完成，可以大大節(jié)約時間和提高工作效率。這一點對于研究人員來說極為有用，因為你不再需要等2個多小時才能看實驗結果了，或者換句話來說，2個多小時你可以做4—5輪定量實驗了。