PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題及回答

1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過(guò)期
*反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)*過(guò)50μl

2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
*常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA
*鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要*過(guò)1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行鏈反應(yīng)。

3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶
*在PCR反應(yīng)體系中鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高
*減少引物的用量
*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
*對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果
*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
*有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
*有可能是由于模板量過(guò)高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。
*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？
*具有更高的熱穩(wěn)定性（達(dá)50℃）
*具有更長(zhǎng)的半衰期（達(dá)220分鐘）
*對(duì)PCR無(wú)抑制
*干冰運(yùn)輸
*Tdt活性更低
9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

10. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？
GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

11. 什么情況下需要使用RNase H？
在輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)

12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：
目的 建議
RT與PCR使用不同的引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高特異性 含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)
高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果 通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到結(jié)果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)