PCR實(shí)驗(yàn)工作原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

一、發(fā)展簡(jiǎn)史

     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在。

    1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。

二、實(shí)驗(yàn)原理

    類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。

首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。

PCR過(guò)程是由變性，退火，延伸3個(gè)步驟組成的不斷重復(fù)的過(guò)程。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DN

2.退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

三、PCR反應(yīng)要素：

1. DNA模版：可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質(zhì)粒DNA，

2. 引物：一對(duì)寡聚DNA，分別與模板兩側(cè)的3’端序列互補(bǔ)，可使DNA序列得到擴(kuò)增

3. DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，

4. 緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的PH,離子強(qiáng)度等環(huán)境

5. 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料

• 實(shí)驗(yàn)材料

     PCR擴(kuò)增儀、PCR反應(yīng)管、PCR離心管、移液器、凝膠電泳設(shè)備、冰盒、離心機(jī)

模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反應(yīng)緩沖液、Mg2+、ddH2O。

• PCR反應(yīng)體系

1. 以DNA為模板的反應(yīng)體系：

  模板：DNA102~105拷貝

  引物

  底物：4種dNTP

  TaqDNA聚合酶

  緩沖液

  體積：

1. 以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）

  模板：RNA

  引物：oligo(dT)12~18

  底物：4種dNTP

  逆轉(zhuǎn)錄酶

  緩沖液

  其他試劑：RNA酶抑制劑，MgCl2.DTT.