成功的凍存過程依賴于下面四個(gè)關(guān)鍵方面：

1. 合適的處理和收集細(xì)胞

2. 合適的凍存液

3. 良好控制的冷凍速率

4. 低溫存儲(chǔ)

        以下描述的方法是針對(duì)典型的生長于含胎牛血清培養(yǎng)液的哺乳動(dòng)物單層貼壁細(xì)胞，經(jīng)簡單后可適用于多種不同的細(xì)胞類型。

      在進(jìn)行凍存以前，需要保證細(xì)胞處于活躍生長的狀態(tài)（對(duì)數(shù)或指數(shù)生長期）以保證細(xì)胞處于zui健康的狀態(tài)從而利于后面的復(fù)蘇。在細(xì)胞收集24小時(shí)前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。同時(shí)我們也推薦對(duì)細(xì)胞進(jìn)行微生物污染檢測(cè)，特別是支原體檢測(cè)，并且使用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)細(xì)胞進(jìn)行特性鑒定（物種和細(xì)胞類型）。

      在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的大體形態(tài)，檢查是否有微生物污染的跡象。同時(shí)我們也需要使用肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)液中是否存在漂浮的小的真菌，由于這些菌體通常漂浮在液面，因此我們?cè)谶M(jìn)行顯微鏡觀察時(shí)通常不容易發(fā)現(xiàn)。如果在我們?nèi)粘５呐囵B(yǎng)過程中使用了抗生素，那么在凍存前的一到兩周的時(shí)間使用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，這樣就很容易檢測(cè)出細(xì)胞中是否存在隱匿的污染。

       通?？蓞⒖寄Ｒ?guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞傳代方法。在細(xì)胞的收集過程中應(yīng)盡可能的輕柔，因?yàn)槿绻诖藭r(shí)細(xì)胞受到損傷，加上細(xì)胞在經(jīng)歷后續(xù)的冷凍和解凍過程中的進(jìn)一步損害，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在復(fù)蘇后難以存活。以下推薦的試劑用量是針對(duì)75-cm2（T-75）的培養(yǎng)瓶而言，如果使用其他規(guī)格的培養(yǎng)容器需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

2a. 使用一個(gè)無菌的吸管將培養(yǎng)液吸除。任何接觸到細(xì)胞的材料和溶液都應(yīng)該進(jìn)行妥善的處理。

2b. 使用5-10ml PBS洗滌一次，以去除殘留的FBS。

2c. 加入3-5ml 胰酶或其他合適的消化液至培養(yǎng)瓶中，37°C孵育。提前預(yù)熱消化液可縮短消化的用時(shí)。

2d. 每隔幾分鐘在倒置顯微鏡下檢查細(xì)胞的消化過程。一旦細(xì)胞變圓，既可輕柔的敲擊培養(yǎng)瓶使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的塑料表面脫落下來。加入5ml含血清的培養(yǎng)液中和胰酶。如有必要可能需要用力吹打以將殘留在培養(yǎng)容器表面的細(xì)胞洗脫下來，同時(shí)將細(xì)胞團(tuán)塊吹打成單細(xì)胞懸液。去除或中和消化液對(duì)于保證凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)的活力非常重要，如果消化液無法被直接滅活也沒有關(guān)系，因?yàn)樗鼘?huì)在接下來的離心步驟中被除去。

2e. 收集細(xì)胞懸液至15ml離心管中。取出一部分懸液放在一邊留作細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余細(xì)胞進(jìn)行100g離心5min以得到疏松的細(xì)胞沉淀。離心的同時(shí)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并使用臺(tái)盼蘭檢測(cè)細(xì)胞的活力。

       凍存液的使用原則是使細(xì)胞在冷凍過程中的損傷降到zui低。多種化學(xué)試劑曾被用作防凍劑，包括聚烯吡酮(polyvinyl-pyrrolidone), 乙二醇(ethylene glycol)，甲醇(methanol)以及甲基乙酰胺(methyl acetamide)等。但zui常使用的防凍劑仍然是二甲亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)和甘油(glycerol)。

DMSO作為防凍劑在凍存液中的比例常在5-10%之間，具體的*濃度依據(jù)細(xì)胞的不同會(huì)有差異。

警告：雖然沒有直接毒性，DMSO是一種強(qiáng)效溶劑并且可以快速沁入接觸的皮膚。因此，使用DMSO存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。請(qǐng)盡量避免接觸到DMSO，處理含DMSO的廢物時(shí)也要非常小心。另外，同樣由于其是一種強(qiáng)效溶劑，某些批次商業(yè)供應(yīng)的DMSO可能污染某些毒性物質(zhì)，因此不可用于細(xì)胞的凍存。

甘油在凍存液中的zui終比例常在5-15%之間，和DMSO一樣，*的濃度仍然取決于具體的細(xì)胞種類。

      增加凍存液中的血清濃度將有助于提高一些難以保存細(xì)胞的活率，偶爾也會(huì)使用高達(dá)90-95%的血清（不添加培養(yǎng)液，只包含血清和抗凍劑），特別是對(duì)于一些敏感的雜交瘤細(xì)胞系。對(duì)于常規(guī)生長在無血清培養(yǎng)液中的細(xì)胞，在凍存液和復(fù)試培養(yǎng)液中添加50%的條件培養(yǎng)基（即無血清培養(yǎng)液經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集的培養(yǎng)上清）可能會(huì)提過細(xì)胞復(fù)蘇后的活力。此外，在無血清凍存液中添加10-20%的細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)白蛋白也可能會(huì)提高凍存后細(xì)胞的存活率。

3a. 棄除上清，將細(xì)胞重懸于足量的細(xì)胞凍存液中，保證zui終每毫升凍存液中細(xì)胞數(shù)為2-5×106。

3b. 標(biāo)記凍存管，要求至少標(biāo)明細(xì)胞的名稱和日期。然后在每個(gè)凍存管中加入1.0-1.8ml的細(xì)胞懸液并旋緊密封。

    緩慢且均勻的降溫速率對(duì)于保證較好的細(xì)胞復(fù)蘇效果非常重要，通常來說每分鐘1到3°C的下降速率適用于大多數(shù)的動(dòng)物細(xì)胞?？刂萍?xì)胞降溫過程的*方案是使用程序電子降溫儀（programmable electronic freezer unit）。但也有許多商業(yè)供應(yīng)的機(jī)械降溫儀，當(dāng)放置于-70至-90°C深低溫冰箱過夜時(shí)，這些降溫儀也可以達(dá)到令人滿意的且可重復(fù)的降溫速率。

4a. 按照生產(chǎn)商的說明，將標(biāo)記的凍存管放置于合適的程序降溫儀中。如果沒有可用商業(yè)化降溫儀，也可以手動(dòng)自制一個(gè)，即將凍存管放入一個(gè)小的聚苯乙烯泡沫或絕緣紙板盒中，然后放入-70至-90°C深低溫冰箱過夜。雖然這種方法適用于多種細(xì)胞系，但其并不能提供一個(gè)可控、勻速或可重復(fù)的降溫過程，因此我們不推薦使用該方法凍存一些貴重的或稀有的細(xì)胞。

4b. 無論使用何種降溫方法，我們都應(yīng)該將凍存的細(xì)胞快速的轉(zhuǎn)移至zui終的存儲(chǔ)地點(diǎn)。如果無法保證及時(shí)轉(zhuǎn)移，可以將凍存管暫時(shí)保存于干冰中，以防止在轉(zhuǎn)移過程中因疏忽導(dǎo)致的臨時(shí)升溫。轉(zhuǎn)移過程中的升溫是導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞活力變差的一個(gè)主要因素。

   為了保證*的活率，應(yīng)始終將細(xì)胞存儲(chǔ)于–130°C以下的低溫中。雖然在更高的溫度下，細(xì)胞也可能存活，但細(xì)胞活率會(huì)隨時(shí)間的推移逐漸降低。

液氮罐是理想的存儲(chǔ)設(shè)備，細(xì)胞既可以浸沒于液氮中也可以位于液氮上方的汽相中。為了安全考慮（以下第6點(diǎn)內(nèi)容），我們更推薦進(jìn)行汽相存儲(chǔ)。

   對(duì)于維護(hù)一個(gè)基于液氮的細(xì)胞庫來說，有幾點(diǎn)是需要特別注意的：

. 確保標(biāo)記系統(tǒng)適用于（*）深冷儲(chǔ)存。

5b. 保持良好的記錄，包括細(xì)胞存儲(chǔ)的位置以及細(xì)胞的特性、增殖以及需要進(jìn)行的處理等一套完整記錄。請(qǐng)記住，細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間很可能比凍存它們的人還要久遠(yuǎn)。

5c. 準(zhǔn)備好應(yīng)急預(yù)案！液氮存儲(chǔ)也可能出現(xiàn)差錯(cuò)。因此應(yīng)該指派專人負(fù)責(zé)經(jīng)常檢查（是每天或至少為一周）液氮罐的狀態(tài)。也可使用一些商業(yè)化的報(bào)警系統(tǒng)用于不間斷的監(jiān)測(cè)液氮罐的工作狀態(tài)。對(duì)于非常重要或*的細(xì)胞，應(yīng)該分別存儲(chǔ)于至少兩個(gè)不同的地點(diǎn)。

        對(duì)于浸沒在液氮中細(xì)胞，在復(fù)蘇時(shí)需要特別留意，如果在存儲(chǔ)過程中凍存管出現(xiàn)泄露，液氮會(huì)緩慢的進(jìn)入其中；這樣在解凍的過程中，液氮的揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致凍存管爆炸或?qū)龃婀苌w掀起，引起碎片飛濺非常危險(xiǎn)。

   安全防護(hù)：在從液氮中取凍存管以及解凍的過程中，要始終穿戴防護(hù)服、手套以及面罩。

6a. 將凍存管置于37°C水浴中，輕輕搖動(dòng)。為了減少污染的可能性，凍存管的O-圈以及蓋子應(yīng)該保持在水面以上。應(yīng)該快速解凍（大約2min）。一旦內(nèi)容物已經(jīng)融化，請(qǐng)立即將凍存管從水浴箱中取出，然后用70%的乙醇進(jìn)行擦拭或噴灑除菌。從這以后，所有的操作應(yīng)在無菌的條件下進(jìn)行。

6b. 將凍存管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至一個(gè)25-cm2的培養(yǎng)瓶或100mm的Dish中，然后加入*培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋（培養(yǎng)瓶大約需要4-5ml，Dish約需10ml）。對(duì)于多數(shù)細(xì)胞系而言，不需要立即去除凍存液，通常可在復(fù)蘇后8-24小時(shí)換液進(jìn)行去除（但對(duì)于一些對(duì)凍存液敏感的細(xì)胞，我們就需要**行細(xì)胞離心以除去凍存液）。然后置于37°C孵育培養(yǎng)。在復(fù)蘇過程中應(yīng)避免使用過度堿性的培養(yǎng)液（研小弟注：通常我們的培養(yǎng)液中都含有酚紅作為pH指示劑，因此這里既盡量不要使用因偏堿而變紫的培養(yǎng)液）。建議事先將培養(yǎng)容器中加入培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育不少于15min，以使培養(yǎng)液達(dá)到其正常的pH值，然后再加入凍存的細(xì)胞。某些細(xì)胞系在解凍后，當(dāng)過于快速的加入大量新鮮培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)滲透壓休克。此時(shí)應(yīng)使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加（每次1-2ml）新鮮培養(yǎng)液的方法，每隔10-20min添加一次新鮮培養(yǎng)液。