檸檬酸鈉緩沖液0.01mol/L，pH6.0，

1.適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法,使得免疫組化結(jié)果更加可靠；推薦使用本法.

2.儀器設(shè)備：市售不銹鋼家用壓力鍋（以不銹鋼制品為好），大小尺寸可根據(jù)需要而定（內(nèi)徑18cm為好）；1000-1500W電爐一臺；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。

3.所需試劑：0.01M檸檬酸型緩沖液，pH=6.0±0.1

4.操作步驟：

（1）常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液（800-1500ml）于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計時，1-2分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫（稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻），取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS（pH=7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘（2×3'）。

（3）按公司有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。

5.注意事項：

（1）加熱時間長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在5-8分鐘為好，時間過長可能會使染色背景加深。

（2）必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH值增高而導(dǎo)致掉片。

（3）高壓鍋離開火源后必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。

（4）為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lysine
（5）緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。

常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化。工作中要認(rèn)真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標(biāo)記效果更理想。

問：為什么要進行抗原修復(fù)：

答：福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當(dāng)部分的抗原不能與抗體很好是進行反應(yīng)。因此，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素。

抗原修復(fù)中檸檬酸緩沖液的配制方法：

A液：枸櫞酸，C₆H₈O₇.H₂O，21.01g 加水定容至1000ml；

B液：枸櫞酸鈉，C₆H₅Na₃O₇.2H₂O, 29.41g 加水定容至1000ml;

使用時： A液9 ml, B液41 ml，加水至500ml，即可配成工作液。

抗原修復(fù)（Antigen retrieval ，AR）技術(shù)，是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(xué)（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復(fù)過程?？乖迯?fù)能zui大程度地恢復(fù)在制片等過程中損失的抗原性，使原來認(rèn)為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結(jié)果，成為一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發(fā)展、應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化。

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