150025凱杰Qiagen微量樣本全基因組擴增試劑盒

凱杰Qiagen150025微量樣本全基因組擴增試劑盒REPLI-G Kits 100T/盒

凱杰QIAGEN在生命科學(xué)研究、應(yīng)用檢測、制藥、和分子診斷領(lǐng)域獲得成功和突破性進展。

150025 凱杰Qiagen微量樣本全基因組擴增試劑盒REPLI-G Kits 100T/盒，產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品品牌：Qiagen
產(chǎn)品貨號：150025
產(chǎn)品名稱：微量樣本全基因組擴增試劑盒
英文名稱：REPLI-G Kits
產(chǎn)品規(guī)格：100T/盒

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150025 凱杰Qiagen微量樣本全基因組擴增試劑盒REPLI-G Kits 100T/盒，產(chǎn)品說明：

DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 100 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 10 µg per reaction)

用于 100 x 50 μl 全基因組擴增反應(yīng)的 DNA 聚合酶、緩沖液和試劑（每次反應(yīng)的典型產(chǎn)量為 10 μg）

特征

l  擴增的 DNA 可用于 NGS、微陣列和 PCR 應(yīng)用

l  等溫多重位移擴增 （MDA） 與校對 DNA 聚合酶

l  全基因組擴增 （WGA） 可從 10 ng DNA 中產(chǎn)生 7 至 40 μg 擴增的 DNA

l  超快格式，可在 1–1.5 小時內(nèi)完成全基因組擴增

l  適用于 96 個樣品的高通量形式，處理時間僅為 20 分鐘

產(chǎn)品詳情

由于基因組DNA數(shù)量不足而可以進行的基因組分析的數(shù)量和類型的限制可以通過對樣本中所有DNA進行全局?jǐn)U增（全基因組擴增）來克服。REPLI-g 試劑盒提供 DNA 聚合酶、緩沖液和試劑，用于高度均勻的全基因組擴增，序列偏差*小，可與各種起始材料一起使用，包括基因組 DNA、新鮮或干燥血液、口腔拭子、新鮮或冷凍組織和細胞。QIAGEN REPLI-g試劑盒有幾種不同的尺寸和配置，使研究人員能夠為其應(yīng)用和實驗室空間構(gòu)建優(yōu)良工作流程。典型的 REPLI-g 產(chǎn)量范圍約為 7 μg 至 40 μg 擴增 DNA，具體取決于所使用的試劑盒和工作流程。

REPLI-g Mini 和 Midi 試劑盒提供單管工作流程，具有更高的擴增 DNA 產(chǎn)量，而 REPLI-g UltraFast 試劑盒可在短短 60–90 分鐘內(nèi)實現(xiàn)高度均勻和準(zhǔn)確的全基因組擴增。對于 96 孔形式的高通量處理，REPLI-g 篩選試劑盒的簡化室溫程序可實現(xiàn)簡單的液體處理，僅需 20 分鐘。REPLI-g 篩選試劑盒旨在使用一系列基因分型、PCR、測序或微陣列檢測進行快速篩選。

Performance

各種樣品的高產(chǎn)量，適用于多種應(yīng)用

各種臨床和非臨床研究樣品可與 REPLI-g 迷你和中型試劑盒一起使用，包括基因組 DNA、新鮮或干燥血液、新鮮或冷凍組織和細胞。每 50 μl 反應(yīng)的典型 DNA 產(chǎn)量始終達到 10 μg（迷你試劑盒）或 40 μg（中型試劑盒），而無論模板DNA的數(shù)量如何，通常都能實現(xiàn)擴增DNA的均勻產(chǎn)量，從不同的模板濃度中獲得均勻的DNA產(chǎn)量始終很重要，但對于高通量應(yīng)用尤其重要，這需要后續(xù)的遺傳分析，而無需額外測量或調(diào)整DNA濃度。

對于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量樣品，REPLI-g 超快迷你試劑盒的平均 DNA 產(chǎn)量為 90 分鐘內(nèi)每 20 μl 反應(yīng) 7–10 μg。如果時間非常有限，只需45分鐘即可獲得足夠的產(chǎn)品進行下游遺傳分析，陰性對照樣品（無模板DNA）不會擴增，從而提供樣品存在/不存在或污染DNA的可靠指標(biāo)

REPLI-g 篩選試劑盒反應(yīng)的典型 DNA 產(chǎn)量為每 40 μl 反應(yīng) 8 μg。擴增的DNA可直接用于各種下游應(yīng)用，包括基因分型（例如SNP、STR、缺失和插入）、終點PCR、定量實時PCR、微陣列和測序。與其他需要在冰上進行反應(yīng)設(shè)置的全基因組擴增程序不同，REPLI-g 篩選試劑盒使用室溫設(shè)置，處理時間僅為 20 分鐘，特別適合并行處理多個樣品。從不同的模板濃度中獲得均勻的DNA產(chǎn)量對于高通量應(yīng)用尤為重要，因為無需測量或調(diào)整DNA濃度即可進行后續(xù)遺傳分析。平均產(chǎn)品長度通常大于 10 kb，范圍在 2 kb 到 100 kb 之間

REPLI-g擴增DNA的平均產(chǎn)物長度通常超過10 kb，范圍在2 kb至100 kb之間，因此可以進行復(fù)雜的限制性內(nèi)切酶分析和長距離PCR等下游應(yīng)用。REPLI-g擴增的DNA非常適合基因分型應(yīng)用，例如使用TaqMan®引物/探針組進行SNP基因分型，測序和STR/微衛(wèi)星分析。

研究人員反饋

“在過去的兩年中，我們一直在多個項目中廣泛使用REPLI-g超快速迷你套件。使用 REPLI-g 試劑盒進行的多次置換擴增能夠以非常低的錯誤率和高覆蓋率忠實地擴增所有 DNA 產(chǎn)物。我們使用該試劑盒的下游應(yīng)用通常包括NGS，但也包括qPCR和微陣列。此外，我們正在努力在微流體或芯片實驗室系統(tǒng)中實施這項技術(shù)，因為該方法不需要復(fù)雜的熱循環(huán)程序。 范蓉博士，美國耶魯大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程助理教授。

成功用于二代測序

許多出版物已經(jīng)證明了REPLI-g擴增DNA在下一代測序（NGS）應(yīng)用中的成功應(yīng)用，從腫*細胞的外顯子組和全基因組測序到宏基因組學(xué)研究，再到單細胞分析（有關(guān)在NGS中成功使用REPLI-g的一系列新出版物，請參閱我們的WGA資源頁面).由于全基因組擴增DNA在NGS和陣列應(yīng)用中的使用一直存在爭議，我們檢測到可能影響在這些下游應(yīng)用中使用擴增DNA成功的潛在因素。我們確定輸入材料的質(zhì)量強烈影響下游NGS實驗的成功。如果使用低質(zhì)量的DNA（例如，降解的DNA）或老化的組織材料，則所得擴增的DNA可能無法給出可靠的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，WGA使用REPLI-g技術(shù)對完整細胞或未降解的純化DNA表明，NGS結(jié)果與純化的gDNA獲得的結(jié)果相當(dāng)?；蚪M位點序列的序列覆蓋率和比對比較表明WGA后垃圾DNA的水平最小化，而擴增和基因組DNA的錯誤率處于相似的百分比范圍內(nèi)。QIAseq FX 單細胞 RNA 和 QIAseq FX 單細胞 DNA 文庫試劑盒利用 REPLI-g MDA 反應(yīng)獲得高質(zhì)量的 NGS 文庫，當(dāng)起始處理 10 pg – 1 ng 的 RNA 或 DNA 時。

高保真全基因組擴增

REPLI-g 技術(shù)可在整個基因組中提供高度均勻的 DNA 擴增。Phi29聚合酶可以復(fù)制高達70 kb，而不會與基因組DNA模板解離。與基于 PCR 的全基因組擴增 （WGA） 技術(shù)相比，Phi29 聚合酶具有 3'→5' 核酸外切酶校對活性，并且在復(fù)制過程中保持高達 1000 倍的保真度。試劑盒中提供的核酸外切酶抗性引物可確保DNA產(chǎn)物的高產(chǎn)量，并且WGA緩沖液系統(tǒng)針對超長讀取長度和無偏位點表示進行了優(yōu)化。

REPLI-g 優(yōu)于基于 PCR 的 WGA 方法

傳統(tǒng)的基因組DNA擴增方法包括創(chuàng)建EBV轉(zhuǎn)化細胞系的耗時過程，然后使用隨機或退化寡核苷*引發(fā)的PCR進行全基因組擴增。此外，其他供應(yīng)商通常使用的基于PCR的方法（例如DOP-PCR和PEP）會產(chǎn)生非特異性擴增偽影，并且無法wan全覆蓋位點。在某些情況下，可能會產(chǎn)生長度小于 1 kb 的 DNA，而這些 DNA 不能用于許多下游應(yīng)用。通常，由于使用了低保真酶Taq DNA聚合酶，生成的DNA具有更高的突變率，這可能導(dǎo)致容易出錯的擴增，例如導(dǎo)致單堿基對突變，STR收縮和擴增。與這些缺點相反，REPLI-g在整個基因組中提供了高度均勻的擴增，在擴增過程中具有*小的基因座偏差和*小的突變率

Principle

放大原理

通常缺乏足夠數(shù)量的基因組DNA進行基因組分析，從而限制了可以執(zhí)行的分析。全基因組擴增（WGA）通過擴增樣品中的整個基因組來克服這一限制，提供足夠的數(shù)量來對同一DNA樣品進行所有分析。REPLI-g技術(shù)在整個基因組中提供高度均勻的DNA擴增，并且序列偏差最小。

該方法基于多重位移擴增（MDA）技術(shù)，該技術(shù)使用等溫基因組擴增和du特的合成Phi 29聚合酶，能夠在不與基因組DNA模板解離的情況下復(fù)制高達100 kb.Phi 29聚合酶在存在核酸外切酶抗性引物的情況下使用，以實現(xiàn)DNA產(chǎn)物的高產(chǎn)量，具有3'→5'核酸外切酶校對活性，保真度比Taq聚合酶高1000倍，可在復(fù)制過程中保持高保真度。在du特、優(yōu)化的 REPLI-g 緩沖液系統(tǒng)的支持下，Phi 29 聚合酶可輕松求解發(fā)夾環(huán)等二級結(jié)構(gòu)，從而防止聚合酶在擴增過程中滑移、停止和解離。這使得能夠產(chǎn)生高達100 kb的DNA片段，而不會出現(xiàn)序列偏差。

DNA的堿性變性

基因組DNA在用于酶擴增程序之前必須變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或增加pH值（化學(xué)堿性孵育）。REPLI-g 試劑盒使用溫和的堿性孵育，允許均勻的 DNA 變性，具有非常低的 DNA 片段化或非堿性位點的生成。這導(dǎo)致擴增的DNA具有非常高的完整性，并zui大化擴增片段的長度，從而使基因組位點和序列得到均勻的表示。使用REPLI-g試劑盒，在后續(xù)下游應(yīng)用中可確?？煽康慕Y(jié)果，沒有假陽性或假陰性數(shù)據(jù)，這與使用熱誘導(dǎo)變性的其他WGA技術(shù)不同，WGA技術(shù)會破壞模板DNA，導(dǎo)致位點偏倚和代表性不足。

Procedure

REPLI-g Mini和MIDI試劑盒使用一種簡單可靠的方法，從少量分離的靶基因組DNA或直接從全血、干血卡、血沉棕黃層和組織培養(yǎng)細胞中實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因組擴增。加入裂解緩沖液，既裂解樣品材料又使DNA變性，然后進行短時間的分鐘孵育。中和后，加入預(yù)混液（包括REPLI-g迷你DNA聚合酶），等溫擴增反應(yīng)在30°C下進行過夜。

使用 REPLI-g 超快迷你試劑盒擴增基因組 DNA 涉及 3 個基本步驟。首先，樣品（10 ng純化的基因組DNA，0.5μl全血或300個組織培養(yǎng)細胞）經(jīng)歷溫和的堿性變性，避免模板DNA的碎裂和損壞。接下來，將樣品中和，最后在30°C下與REPLI-g超快DNA聚合酶一起孵育。 擴增的DNA在60分鐘后即可使用，無需進一步純化。

非?？焖?、簡單和準(zhǔn)確的 REPLI-g 篩選方法能夠?qū)Χ鄠€基因組樣本進行平行擴增，如 REPLI-g 篩選手冊中所述。裂解樣品材料，并通過在1°C下與緩沖液SB65孵育使DNA變性。 通過冷卻至室溫來停止變性。加入緩沖液SB2和DNA聚合酶，等溫擴增進行至少10小時或在30°C下過夜。

整個反應(yīng)設(shè)置在室溫下進行，因此易于與液體處理儀器一起使用。96 個樣品的反應(yīng)設(shè)置僅需 20 分鐘，節(jié)省了專注于其他重要任務(wù)的時間。REPLI-g篩選試劑盒結(jié)合了許多功能，使其非常適合用于手動或自動高通量突變篩選，包括用于提高準(zhǔn)確性的大容量移液步驟，與96孔微孔板兼容，以及簡化的方案，以實現(xiàn)快速簡便的設(shè)置。

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Applications

l  REPLI-g擴增的基因組可用于各種下游應(yīng)用，包括：

l  使用 TaqMan® 引物/探針組進行 SNP 基因分型

l  基于 qPCR 和 PCR 的突變檢測

l  二代測序

l  可疑交易報告/微衛(wèi)星分析

l  桑格測序

l  RFLP 和 Southern 印跡分析

l  陣列技術(shù)，如比較基因組雜交

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