徠卡熒光顯微鏡

徠卡熒光顯微鏡

徠卡熒光顯微鏡

：李小兵

在熒光顯微鏡的基本原理是細胞成分有熒光劑的幫助的非常具體的可視化。這可以是熒光蛋白 - 例如綠色熒光蛋白 - 基因與感興趣的蛋白質(zhì)。如果克隆是不可能的 - 例如組織學標本中 - 這是需要使用其他技術(shù)，如免疫熒光染色來可視化目的蛋白質(zhì)。用于此目的的抗體的利用，這是可以直接或間接地連接到不同的熒光染料和結(jié)合到適當?shù)哪繕私Y(jié)構(gòu)。此外，與熒光染料的徠卡熒光顯微鏡的幫助下，不于蛋白，但它也提供了機會染色核酸，多糖和其他結(jié)構(gòu)?？梢詸z測甚非生物物質(zhì)，如鈣離子。本文介紹了常用的熒光劑。

熒光免疫

在熒光顯微鏡有兩種方式來可視化你的目標蛋白。無論是與一個固有熒光信號的幫助下 - 這意味著通過克隆，因此基因連接的熒光蛋白與靶蛋白?；蚪柚鸁晒鈽擞浀奶禺愋越Y(jié)合到感興趣的蛋白質(zhì)的抗體。對于一些生物的問題是比較有用的，甚需要進行后者。在組織學樣品的情況下，例如，它不可能使用的，因為在一般的樣品被從其中不持有任何熒光蛋白的生物來源的熒光蛋白。此外，如果一個有效的抗體可用，免疫比熒光蛋白技術(shù)快得多，是你要克隆的興趣和轉(zhuǎn)染的DNA的基因插入到適當?shù)募毎?。熒光蛋白的另一個缺點在于身為蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)。有了它，它們具有可導致功能障礙或誤解關(guān)于感興趣的附著蛋白的細胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)性的特點。然而，應當認為，使用熒光蛋白是通常選擇的方法來觀察活細胞。 

免疫熒光法利用抗體與其抗原的非常特異性結(jié)合親和力的。這可以有兩種不同的外觀。簡單的方法是使用一種被結(jié)合到感興趣的蛋白的熒光標記的抗體。這就是所謂的直接免疫熒光。 

在大多數(shù)情況下，有兩種形式的抗體的使用。*個結(jié)合靶蛋白并沒有熒光標記本身（*抗體）。但是，第二個（第二抗體），其結(jié)合*抗體特異性帶有熒光染料。這種方法被稱為間接免疫熒光和具有若干優(yōu)點。一方面有一個放大的效果，因為多于一個的第二抗體結(jié)合于一個*抗體。另一方面，沒有必要所有的時間標記每個抗體對您喜歡的蛋白與熒光染料而使用的商業(yè)熒光標記的第二抗體。廣泛使用的熒光染料的免疫是FITC，TRITC或都提到了以下幾個Alexa的Fluor?染料。

FITC 和TRITC

異硫氰酸熒光素（FITC）是有機熒光染料仍然在免疫熒光和流式細胞術(shù)使用。它的激發(fā)/發(fā)射峰在517分之495nm和可耦合到不同的抗體，其反應性異硫氰酸酯基，其上結(jié)合的蛋白質(zhì)的氨基，巰基，咪唑基，酪氨酰基或羰基的幫助。它的基本形式 - 熒光素 - 具有332克/摩爾的摩爾質(zhì)量，并經(jīng)常被用來作為熒光示蹤劑。 FITC（388克/摩爾），這是用于熒光顯微鏡和服務為原點進行進一步的熒光染料類的AlexaFluor?488*的染料之一。其熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，它是由光的藍色光譜激發(fā)。

圖1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC       圖2：小鼠成纖維細胞，綠色F-肌動蛋白，F(xiàn)ITC Red：Tubulin, Cy5, 藍色：細胞核，DAPI

很多時候同日而語用FITC使用的染料是它的發(fā)音相似的伙伴TRITC（四甲-5（6）-isothiocyanate）。相反，F(xiàn)ITC，TRITC不是熒光素，但羅丹明家族的衍生物。羅丹明也有一個大的共軛芳族電子系統(tǒng)，是什么導致了它們的熒光行為。相反，F(xiàn)ITC，TRITC（478克/摩爾）為激發(fā)光在綠色光譜，大在550nm處。其大發(fā)射是在撒謊，在573納米。鍵合到蛋白質(zhì)（如抗體）也基于反應性異硫氰酸酯基團。 

即使FITC和TRITC仍然在使用，它們是相當弱的熒光染料和不*用于本域顯微鏡的狀態(tài)。他們的利潤是根據(jù)自己的經(jīng)濟代價。

花青

這種相對小集合熒光染料是來自菁這也是起源于他們的名字的Cy2，Cy3，Cy5和Cy7標記。所有的人都可以通過它們的反應性基團被連接到核酸或蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)性標簽使用的馬來酰亞胺基團，例如。有趣的 - 有關(guān)熒光 - Cy5的是其電子周圍敏感。這可以用于酶測定。的附連蛋白導致正的或負的變化中的熒光發(fā)射的構(gòu)象變化。此外Cy3和Cy5可用于FRET實驗?；ㄇ嗳玖鲜潜容^老的熒光染料和依據(jù)其他熒光染料具有改進的亮度，耐光性，量子產(chǎn)率等。

Alexa Fluor?染料

Alexa Fluor?染料這是經(jīng)常使用的熒光顯微鏡一大群的帶負電荷的親水性和熒光染料。他們的稱謂可追溯到它的理查德·保羅·豪格蘭誰任命他的兒子亞歷克斯畢浩然后的染料。該標簽是分子探針（生命技術(shù)的附屬公司）的注冊商標。此外，各激光的激發(fā)波長中提到他們的標簽。例如在非常廣泛使用的AlexaFluor?488具有大激發(fā)，在493納米，它允許勵磁用標準488nm的激光。 Alexa Fluor?488具有發(fā)射大值在519納米。與此特征，Alexa Fluor?488具有非常相似的性質(zhì)，以FITC。雖然Alexa Fluor?488是熒光素衍生物，而相比之下，F(xiàn)ITC它具有更好的穩(wěn)定性，亮度和較低的pH敏感性。所有的AlexaFluor?染料是不同的基本的熒光物質(zhì)如熒光素，香豆素類，花青或羅丹明（如Alexa Fluor?546，Alexa Fluor?633）的磺化形式。它們的摩爾質(zhì)量范圍為4101400克/摩爾。

圖3：轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎，interlimb體節(jié)，在10.5天的轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的五interlimb體節(jié)：EpaxialMyf5綠色熒光蛋白;免疫染色的GFP-Alexa的488;沾上結(jié)蛋白，Cy3的胚胎肌纖維，細胞核被發(fā)現(xiàn)用Hoechst大小從上到下：3.5毫米（一），800微米（B）。奧莉喬瑞，Cellules Souches與發(fā)展協(xié)會，巴斯德研究所，法巴黎和IGBMC，IGBMC成像中心：禮貌

圖4：小鼠成纖維細胞，綠色F-肌動蛋白，F(xiàn)ITC紅：微管蛋白，Cy5 ，藍色：細胞核的DAPI。君特·吉斯博士，馬普醫(yī)學研究所，德海德堡：禮貌

DNA染色

在熒光顯微鏡不僅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的利益，也有核酸。有時有必要通過其核的檢測，以確定細胞的確切位置或數(shù)量。一種常見的DNA污斑是DAPI（4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚），其結(jié)合在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的豐富的區(qū)域。 DAPI熒光強度增加，如果附著的DNA相比，其未綁定狀態(tài)。據(jù)興奮紫外光，大的358納米。發(fā)射譜很廣，在461 nm的峰值。弱熒光，也可用于RNA結(jié)合檢測。在這種情況下，發(fā)射偏移到500nm。有趣的是，DAPI是能夠滲透完整的細胞膜。因此，它可以在固定，以及在活體細胞中。 

第二個廣泛使用的DNA染色方法是染料Hoechst公司，它初是由化工企業(yè)赫斯特公司的家庭。赫斯特33258，赫斯特33342，和赫斯特34580頃雙 - benzimides與嵌入傾向的AT豐富的地區(qū)，于是后者不使用非常頻繁。類似DAPI它們通過紫外光激發(fā)而具有發(fā)射大值在455納米，它被移動到510-540毫微米以未結(jié)合狀態(tài)。 Hoechst的污漬也被細胞滲透性，可以在固定和活細胞，因此可以使用。的差異，以DAPI是其較低的毒性。

一種膜防滲的DNA染色是丙啶，碘化物。它，它通常用于在細胞培養(yǎng)活細胞和死細胞之間進行區(qū)分，因為它不能老是進入完整細胞。 Propidium-碘化物也嵌入劑，但沒有約束力的偏好不同的堿基。在核酸結(jié)合的狀態(tài)下，其大激發(fā)是在538納米。高排放為617納米。未綁定丙啶，碘激發(fā)和發(fā)射大值被移到較低的波長和強度較低。它也可以結(jié)合RNA，而不改變它的熒光特性。區(qū)分的RNA的DNA，需要使用適當?shù)暮怂崦浮?nbsp;

染料，其能夠使以前無操縱的DNA和RNA之間的差是吖啶橙。它的激發(fā)/發(fā)射大對在DNA版502納米/525納米和轉(zhuǎn)向460納米/650納米的綁定RNA的狀態(tài)。此外，它能夠進入酸性隔室等溶酶體。有陽離子染料被質(zhì)子化。在此酸性吖啶橙周圍被光在藍色光譜激發(fā)的，而發(fā)射是強的橙色區(qū)域。由于細胞凋亡有很多吞沒酸性車廂這使得它經(jīng)常被用來標記那些類型的細胞。

艙和細胞器的特定染料

圖5：Pukinje細胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標記矢狀竇旁一節(jié)。紅色：抗鈣結(jié)合蛋白-D28K/ Cy3的，綠色環(huán)保：抗GFAP/ Cy5的，藍色：赫斯特33258

圖6：牛肺血管內(nèi)皮細胞。紅色：線粒體標記MitoTracker?紅CMXRos，綠色F-肌動蛋白標記的綠色熒光BODIPY?FL phallacidin，藍色：DAPI標記的細胞核。使用3D盲解卷積此圖像增強

在熒光顯微鏡中是經(jīng)常合理染色細胞區(qū)室像溶酶體或內(nèi)體和細胞器像線粒體。為此，有將在本節(jié)中提到的具體可用染料的調(diào)色板。

一種公知的方法來觀察線粒體是MitoTracker?的利用率。這是一種細胞滲透性染料有輕微巰基反應性氯部分。有了它，就可以通過共價鍵與半胱氨酸殘基的游離巰基反應結(jié)合到基質(zhì)蛋白。 MitoTracker?存在以不同的顏色和修改（第表1）和是Molecular Probes公司的一個注冊商標。相反，如羅丹明123或tetramethylrosamine傳統(tǒng)線粒體特定污漬，MitoTracker?不破壞膜電位與固定劑后沖了出去。

根據(jù)線粒體的污漬也有染料標記的酸性區(qū)室像溶酶體被稱為LysoTracker。這些都是鏈接到熒光膜滲透性弱堿性。很可能這些堿有，因為質(zhì)子的酸性區(qū)室的親和力。 LysoTrackers也以不同的顏色（S表1）可用。

一個可比較艙溶酶體是像釀酒酵母真菌液泡。此膜的封閉空間是酸性性質(zhì)也?？梢暬跓晒怙@微鏡中的一種方法是使用苯乙烯基染料等調(diào)頻4-64?或FM5-95?。

當涉及到蛋白分泌實驗，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種特殊的興趣。一個經(jīng)典的染料來染色這個車廂是DiOC6（3）。它有一個偏好的急診室，但仍綁定到其他膜像線粒體。另一種方法特異性染色質(zhì)網(wǎng)是用ER-跟蹤器一樣ER-跟蹤綠色和紅色。兩者都是它們與格列本脲腎上腺素類染料 - 一個sulfonylurease - 它結(jié)合到ATP敏感性鉀通道的*駐留在ER膜。 BODIPY（硼 - 二吡咯亞甲基）描述了一組相對pH值不敏感的染料幾乎都是水不溶性的。這并沒有使他們的蛋白質(zhì)標記，但脂質(zhì)和膜標簽的一個很好的工具。

相鄰的車廂內(nèi)質(zhì)網(wǎng) - 高爾基appararatus - 可以用熒光神經(jīng)酰胺類似物如NBD C6-神經(jīng)酰胺和BODIPY FL C5-神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺是鞘脂的高度富集于高爾基體。

隨著進一步基于脂質(zhì)染料的幫助有可能弄臟特殊膜區(qū)域樣脂質(zhì)筏。這些富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇除其他（Avanti極性脂質(zhì)）被可視化。 

除了使用特殊的非proteinacous熒光染料標記的細胞區(qū)室，也可以染色的與蛋白質(zhì)的幫助下與偏好在小區(qū)的不同位置感興趣的區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以被鏈接到的熒光染料和可視化的熒光顯微鏡。一個示例為這樣一種方法是麥胚凝集素（WGA）的用法，其特異性地結(jié)合于唾液酸和N-乙酰葡糖氨基存在于質(zhì)膜上。 WGA被耦合到熒光染料。與之質(zhì)膜可以被觀察到。

離子成像

在神經(jīng)元的研究中，基因的活性或細胞運動的情況下 - 例如 - 它是感興趣了解的細胞中的離子濃度。鈉，鈣，氯離子或鎂離子具有在許多不同的細胞事件的深刻影響。通常，離子可被捕獲與熒光標記的螯合劑，當綁定到適當?shù)碾x子而改變它們的光譜性質(zhì)的幫助。這個原理體現(xiàn)在鈣指標呋喃-2，吲-1，熒光 - 3，熒光4和鈣綠，例如。 

鈉檢測，SBFI（鈉結(jié)合benzofurzanisophthalate）或綠色鈉是常用的。 PBFI（鉀結(jié)合苯并呋喃間苯二甲酸）檢測鉀離子。 

有趣的是也有基于蛋白質(zhì)的鈣指標。其中之一是基于化學發(fā)光的水母蛋白水母發(fā)光蛋白。水母發(fā)光蛋白的發(fā)光團腔腸素，分子氧和Ca2 +的相互作用導致了藍色的光的 - 在熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)非常突出的機構(gòu)。