ELISpot（Enzyme-linked ImmunoSpot Assay）全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA）的基礎(chǔ)上結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。ELISpot捕獲的目標(biāo)來自于包被板中培養(yǎng)的細(xì)胞在刺激下新鮮分泌的蛋白（抗體或者細(xì)胞因子等），去除細(xì)胞后，通過酶促反應(yīng)放大效應(yīng)展現(xiàn)出有色斑點。ELISpot是一種高度敏感的免疫檢測技術(shù)，可在單細(xì)胞水平檢測分泌細(xì)胞的頻率，從而可以對樣本中活細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)的監(jiān)測評估。

FluoroSpot技術(shù)是ELISpot技術(shù)的進(jìn)階，通過熒光團(tuán)而不是酶和底物組合對斑點進(jìn)行可視化，從而改進(jìn)了雙酶聯(lián)斑點的檢測。FluoroSpot技術(shù)將不同發(fā)射波長的熒光團(tuán)混合在一起，只要加一張濾光片，就可以精確的濾出目標(biāo)熒光，而遮蔽掉其它顏色熒光，熒光之間可以互不干擾。這對于雙因子，甚至多因子ELISpot檢測都是十分理想的手段[1]。

ELISpot/FluoroSpot技術(shù)簡要的實驗流程如圖1所示：

（1）單克隆包被抗體加入乙醇預(yù)混的PVDF膜96孔板中進(jìn)行包被；

（2）接種細(xì)胞并加入相應(yīng)的刺激物進(jìn)行孵育；

（3）分泌的蛋白（抗體或者細(xì)胞因子等）被包被抗體捕獲；

（4）去除細(xì)胞，加入相應(yīng)的檢測抗體（ELISpot為生物素標(biāo)記抗體，F(xiàn)luoroSpot為熒光標(biāo)記抗體或Tag標(biāo)簽標(biāo)記抗體）；

（5）加入酶偶聯(lián)鏈霉親和素（ELISpot）/加入抗標(biāo)簽的熒光標(biāo)記抗體（FluoroSpot）；

（6）加入底物，在酶促作用下顯色斑點（ELISpot）/在激發(fā)光的作用下檢測發(fā)射光（FluoroSpot）。

圖1：ELISpot/FluoroSpot技術(shù)簡要的實驗流程

高靈敏度

ELISpot理論上可達(dá)到百萬分之一的靈敏度，也就是說，在一百萬個細(xì)胞中只要有一個分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞就能檢測出來。實際中，由于考慮到細(xì)胞在孔的底部形成單層而不堆積，一般96孔板中最多鋪40~60萬個細(xì)胞/孔，所以實際中ELISpot也可以達(dá)到幾十萬分之一的級別。比傳統(tǒng)的ELISA方法和流式方法（細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法ICS）高2~3個數(shù)量級，是目前為止最為靈敏的免疫檢測技術(shù)。

單細(xì)胞水平

ELISpot技術(shù)為一種單細(xì)胞水平、活細(xì)胞功能檢測。檢測的是單個細(xì)胞分泌，而非細(xì)胞群體的平均分泌，對研究生物體的細(xì)胞免疫和細(xì)胞功能提供有效的檢測策略。也就是說，ELISpot這種基于單細(xì)胞水平的檢測可以提供更多的免疫信息。

功能性檢測

ELISpot檢測是動態(tài)的免疫檢測，斑點代表分泌細(xì)胞在一段時間內(nèi)的分泌動態(tài)，即“Footprint"。斑點的強(qiáng)弱和數(shù)量反映了細(xì)胞對刺激物的反應(yīng)能力和分泌細(xì)胞因子的動態(tài)能力，這是體現(xiàn)細(xì)胞免疫反應(yīng)最重要的功能指標(biāo)。而ELISA只能檢測細(xì)胞已分泌到上清中的遺留物，只能間接的反映細(xì)胞功能；流式細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法ICS是把本該分泌出來的細(xì)胞因子人為的固定在細(xì)胞內(nèi)，從而反映細(xì)胞應(yīng)對刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，而不能真實的反應(yīng)檢測細(xì)胞的免疫狀態(tài)和分泌細(xì)胞因子的能力。

高通量檢測

ELISpot整個流程基于96孔微孔板，適用于高通量實驗和篩選[2]。

FluoroSpot技術(shù)可以說是ELISpot技術(shù)的進(jìn)階，其優(yōu)勢非常明顯，除了具有ELISpot的優(yōu)勢外，還能實現(xiàn)在同一孔中對單細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子進(jìn)行同時檢測，更節(jié)省時間、樣本，更好的保證樣本批次的一致性。更重要的是能夠分辨僅分泌單因子、分泌雙因子或三因子甚至四因子的細(xì)胞，結(jié)合多種因子的分泌更準(zhǔn)確地對細(xì)胞的亞群進(jìn)行鑒定，實現(xiàn)細(xì)胞群體的多功能性分析。

基于ELISpot/FluoroSpot技術(shù)的高靈敏度、高通量、單細(xì)胞水平、功能檢測等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究和臨床應(yīng)用，例如疫苗的研發(fā)和臨床評估，基因與細(xì)胞治療、移植評估等。

疫苗的研發(fā)和臨床評估

早在2003年發(fā)布的《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中指出“在評價細(xì)胞免疫效價時，應(yīng)當(dāng)建立檢測評價細(xì)胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等）"。而2020年CDE發(fā)布的《xin guan冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究》指導(dǎo)原則中也強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗的質(zhì)量研究需要進(jìn)行體內(nèi)效力試驗，推薦使用ELISpot技術(shù)檢測評價mRNA疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

ELISPOT是一種高度敏感的檢測方法，可檢測體外抗原刺激后PBMC中單個細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子。最常測量的細(xì)胞因子是IFN-γ ，其可由CD4+（Th1）和CD8+（細(xì)胞毒性）T細(xì)胞分泌。根據(jù)起始細(xì)胞（完整PBMC或CD4細(xì)胞耗盡的PBMC）和用于刺激的抗原（全蛋白、活的或滅活/殺死的病毒、肽），該測定可用于測量由CD4+和/或CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ。并且可進(jìn)一步比較CD4和CD8T細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。在健康供體中，大多數(shù)抗原特異性T細(xì)胞的百分比通常低于1:100000 PBMC的檢測限。然而，在病毒感染期間或疫苗接種后，存在于外周的抗原特異性T細(xì)胞的百分比會顯著增加。因此，免疫或感染后特異性T細(xì)胞前體頻率的增加將表明疫苗/病原體誘導(dǎo)的陽性免疫應(yīng)答。ELISpot技術(shù)已經(jīng)成為評價疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)有效的指標(biāo)[3]。

病毒肺炎是一種由冠狀病毒引發(fā)的肺部炎癥，xin guan疫苗是預(yù)防新冠的有效方法，目前多款疫苗已上市或進(jìn)入臨床試驗階段。據(jù)報道隨著新突變株的出現(xiàn)，出現(xiàn)了中和抗體逃逸的現(xiàn)象，但是細(xì)胞免疫非常穩(wěn)定；而且隨著時間的推移，體液免疫（中和抗體）有所下降，但是細(xì)胞免疫非常強(qiáng)大且穩(wěn)定。因此抗體至關(guān)重要，T細(xì)胞免疫功能的評估也是至關(guān)重要的。由中國工程院陳薇院士團(tuán)隊和康希諾生物公司（CanSino Biologics）共同研發(fā)的腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗在I-III期臨床以及霧化腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗I期臨床實驗中采用ELISpot技術(shù)評估細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)行驗證免疫原性和安全性[4]，如圖2所示。

圖2：霧化腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗I期臨床ELISpot實驗

考慮到一些無癥狀病毒接觸病例與無血清轉(zhuǎn)化的細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)，表明在缺少中和抗體的情況下SARS-CoV-2特異性T細(xì)胞可能與疾病控制相關(guān)[5]。BioNTech和輝瑞共同研發(fā)的mRNA疫苗（BNT162b1，BNT162b2）采用ELISpot技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞免疫藥效學(xué)評估以及疫苗誘導(dǎo)免疫原性分析[6, 7]，如圖3所示。

圖3：mRNA疫苗ELISpot實驗

在流感疫苗中利用免疫斑點平臺的高靈敏度，將其與熒光團(tuán)標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體結(jié)合（FluoroSpot），在單細(xì)胞水平上同時測量IFN-γ和IL-2分泌，以評估pH1N1的異亞型記憶T細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子特征，并進(jìn)行深入的探索研究。其中發(fā)現(xiàn)未感染H1N1的成年人具有很高的預(yù)先存在的、循環(huán)的pH1N1特異性僅分泌IFN-γ 的CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞[8]，如圖4所示。

圖4：pH1N1的異亞型記憶T細(xì)胞FluoroSpot實驗

滅活流感疫苗主要通過誘導(dǎo)菌株特異性抗體來提供保護(hù)性免疫。由于持續(xù)的抗原漂移和偶爾的變化，迫切需要能夠誘導(dǎo)更廣泛保護(hù)的疫苗。歷史證據(jù)表明，在缺乏流感特異性抗體的情況下，流感特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞在從流感感染恢復(fù)中發(fā)揮重要作用[9, 10]。減毒流感活疫苗LAIV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性T細(xì)胞對漂移菌株具有交叉反應(yīng)性的概念，提供了潛在的臨床保護(hù)。研究了專注于局部扁桃體組織中的早期T細(xì)胞反應(yīng)，以研究LAIV是否在扁桃體中誘導(dǎo)交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。研究了接種LAIV后扁桃體和外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中的菌株特異性T細(xì)胞反應(yīng)以及扁桃體中交叉反應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[11]，如圖5所示。

圖5：LAIV疫苗ELISpot實驗

基因與細(xì)胞治療

癌癥的發(fā)生與發(fā)展是機(jī)體細(xì)胞免疫機(jī)能減弱的結(jié)果，增強(qiáng)機(jī)體針對癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)是癌癥治療的重要措施之一。在介導(dǎo)腫瘤免疫治療中，T細(xì)胞具有舉足輕重的地位。ELISpot和FluoroSpot技術(shù)可以檢測腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)，并通過檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞釋放的顆粒酶B或穿孔素來表征細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性機(jī)制。ELISpot和FluoroSpot技術(shù)通常可用于評估癌癥疫苗的功效，也可用于鑒定特定的腫瘤抗原。在癌癥研究中使用ELISpot不僅可以評估T細(xì)胞，也可評估B細(xì)胞用于監(jiān)測癌癥疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的質(zhì)量和持續(xù)時間。多發(fā)性骨髓瘤治療后的高復(fù)發(fā)率仍然是一個未解決的問題。免疫療法，尤其是CAR-T療法，由于其非交叉耐藥機(jī)制，被認(rèn)為是治療這種惡性腫瘤的最有希望的策略[12]。然而，即使在CAR-T治療后，患者最終也會復(fù)發(fā)。因此，針對不同靶點的聯(lián)合治療可能是一種合理的策略。一些研究在使用自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因T（TCR-T）細(xì)胞聯(lián)合治療骨髓瘤方面取得了突破。通過人IFN-γ ELISpot 實驗鑒定出AKAP4中的CTL表位，該表位可用于開發(fā)癌癥疫苗或T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞（TCR-T）以殺死骨髓瘤細(xì)胞[13]，如圖6所示。

圖6：AKAP4 人IFN-γ ELISpot 實驗

以AAV病毒為載體的基因治療，在給病人治療中，理論上沒有已知的相關(guān)病理，但在實際應(yīng)用中可能會導(dǎo)致意外的免疫反應(yīng)，這可能會降低治療效率，并可能會帶來安全風(fēng)險。通過ELISPOT的技術(shù)評估病毒載體在人體是否能引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)是臨床階段評估基因治療安全性重要的指標(biāo)參數(shù)。基于治療的發(fā)展階段，生物分布、脫落和免疫原性已成為非臨床和臨床開發(fā)基因療法安全性評估的重要組成部分[14]。

移植

ELISpot檢測可以提供移植前后受者免疫反應(yīng)的有價值信息，在預(yù)測同種異體移植排斥反應(yīng)風(fēng)險和發(fā)生率及存活率方面具有重要的臨床意義。受者和器官供體之間人類白細(xì)胞抗原（HLA）和其他多態(tài)性抗原系統(tǒng)的差異導(dǎo)致移植后發(fā)生同種異體排斥反應(yīng)。預(yù)測受者對移植器官的免疫反應(yīng)可使用個體化免疫抑制方案減少排斥反應(yīng)的發(fā)生率。酶聯(lián)免疫吸附斑點（ELISpot）測定法因其通過評估T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性預(yù)測排斥反應(yīng)的能力而受到廣泛研究。Hricik et al. (2003)第一個注意到陽性IFN-γ ELISpots與HLA錯配數(shù)量之間正相關(guān)的趨勢。Tung TH et. al., （2005）用ELISPOT監(jiān)視患者體內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)，可以有針對性的用藥，避免盲目的使用免疫抑制劑。Slavcev et al.（2015）觀察到IFN-γ分泌細(xì)胞的頻率與HLA錯配的數(shù)量之間存在明顯的關(guān)系。Luque（2018）記錄了一種B細(xì)胞FluoroSpot分析，該分析能夠列舉來源于循環(huán)供體反應(yīng)性記憶B細(xì)胞的多種HLA特異性抗體分泌細(xì)胞。有助于指導(dǎo)新的治療方法，并提供移植前后受者免疫反應(yīng)的臨床相關(guān)數(shù)據(jù)[15]。

隨著ELISpot/FluoroSpot技術(shù)的成熟，以及越來越多的標(biāo)準(zhǔn)化試劑、材料、儀器的加入，使得此技術(shù)方法在實驗室間的應(yīng)用得到穩(wěn)定性和標(biāo)準(zhǔn)化的保障。相關(guān)的行業(yè)內(nèi)指導(dǎo)也有助于增強(qiáng)檢測方法的科學(xué)性、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，使得ELISpot/FluoroSpot技術(shù)運用到更多的生物醫(yī)藥生物分析中。

陽光德美在2019年開始建立肽類藥物、核酸類藥物以及RSV、AAV病毒載體藥物的PK、PD、ADA研究服務(wù)平臺，從軟硬件建設(shè)，人員團(tuán)隊能力建設(shè)，質(zhì)量體系建設(shè)，項目管理等多維度下功夫，目前已成功開發(fā)并實際應(yīng)用I期臨床研究中多種肽類藥物方法、反義核酸藥物方法，包括在胰島素類藥物的生物分析方面有著豐富的經(jīng)驗。目前在肽類藥物及核酸類藥物方面服務(wù)于國內(nèi)胰島素頭部企業(yè)，國內(nèi)大型綜合型藥企的核酸平臺品種及多家新型Biotech肽類企業(yè)。陽光德美一直秉持著“質(zhì)量是陽光德美的立身之本，效率是陽光德美的強(qiáng)身之道"的信念。在未來的發(fā)展中，陽光德美將一如既往地以科學(xué)、高效、準(zhǔn)確的精神為指導(dǎo)，行業(yè)、創(chuàng)譽(yù)中外，與社會各界朋友精誠合作，攜手奮進(jìn)，共創(chuàng)生物樣品分析領(lǐng)域更加輝煌的明天。