今天想給大家介紹另一種分泌型細(xì)胞因子的檢測(cè)方法，也就是ELISPOT技術(shù)，它是目前用于細(xì)胞因子檢測(cè)靈敏的實(shí)驗(yàn)方法。
01
Enzyme-linked Immunospot Assay，即ELISPOT，全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)。該技術(shù)同時(shí)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況（ELISPOT實(shí)際上是雙夾心ELISA的延伸和發(fā)展，可以看作單細(xì)胞水平的ELISA）。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：①靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)；②單細(xì)胞水平評(píng)價(jià)活細(xì)胞功能；③操作簡(jiǎn)單，可進(jìn)行高通量篩選。
ELISPOT常見(jiàn)的應(yīng)用領(lǐng)域包括：T/B細(xì)胞功能研究、自身免疫檢測(cè)、yizhi、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)、腫瘤研究、傳染病的研究和檢測(cè)、病毒研究等。ELISPOT技術(shù)最初用于B淋巴細(xì)胞分泌抗體的檢測(cè)。由于B細(xì)胞分泌的抗體量一般較大，容易檢測(cè)，即使早期ELISPOT檢測(cè)靈敏度不高，但是用于抗體檢測(cè)還是綽綽有余。后面隨著技術(shù)的進(jìn)步，ELISPOT檢測(cè)的靈敏度越來(lái)越高，因此被更多地用于痕量細(xì)胞因子的檢測(cè)。ELISPOT用于T細(xì)胞功能評(píng)價(jià)時(shí)，能夠區(qū)分活化的T細(xì)胞亞群，例如，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α，Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等。目前利用ELISPOT檢測(cè)T細(xì)胞分泌IFN-γ的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用，尤其在疫苗有效性評(píng)價(jià)中具有重要意義，原因：① IFN-γ與CD8 T細(xì)胞的溶細(xì)胞活性密切相關(guān)；② CD4 T細(xì)胞參與的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生IFN-γ。
02
ELISPOT實(shí)驗(yàn)原理
ELISPOT實(shí)驗(yàn)原理如圖1：
a：ELISPOT 實(shí)驗(yàn)在96孔板上進(jìn)行，使用 PVDF 膜作為基質(zhì)，膜上包被特異性的單克隆抗體（抗體須無(wú)毒，不含內(nèi)毒素，親和力高），以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。
b：待測(cè)細(xì)胞和刺激物（抗原或絲裂原）在板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，此時(shí)待測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠被包被在膜上的抗體特異性地捕獲。
c：去除細(xì)胞后，加入生物素標(biāo)記的二抗，可與被捕獲的細(xì)胞因子相結(jié)合。
d：然后加入酶標(biāo)親和素與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色反應(yīng)，此時(shí)可以在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形斑點(diǎn)e，一個(gè)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。
e：特異性抗原再刺激引流淋巴結(jié)細(xì)胞9天進(jìn)行小鼠IFN-γ ELISPOT檢測(cè)結(jié)果。
陽(yáng)性細(xì)胞率%=膜斑點(diǎn)數(shù)/加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%
圖1 ELISPOT技術(shù)檢測(cè)原理[1]
注：也可以直接使用熒光素標(biāo)記二抗與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，此時(shí)不再需要進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，可以一次檢測(cè)多種細(xì)胞因子。但是作為膜板材質(zhì)的NC膜和PVDF膜具有自發(fā)熒光的問(wèn)題，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果背景升高。
實(shí)驗(yàn)所使用的的配對(duì)抗體對(duì)于斑點(diǎn)形成的靈敏度具有重要影響，以下兩圖列出了小鼠和人進(jìn)行細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中推薦使用的配對(duì)抗體?？贵w可以從多種商業(yè)途徑獲得，包括eBiosciences、Biolegend、BD Biosciences和Thermo Scientific等。
圖2 小鼠細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)推薦使用的配對(duì)抗體[1]
圖3 人細(xì)胞因子ELISPOT實(shí)驗(yàn)推薦使用的配對(duì)抗體[1]
以下過(guò)程1（抗原包被）和2（細(xì)胞培養(yǎng)）必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，過(guò)程3（細(xì)胞因子檢測(cè)）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌特異性抗體的B細(xì)胞，該過(guò)程的原理和步驟與細(xì)胞因子ELISPOT測(cè)定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。
（1）準(zhǔn)備無(wú)菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。
注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細(xì)的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問(wèn)題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強(qiáng)其蛋白結(jié)合能力（潤(rùn)濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。
（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇?xì)埩簟?/span>
注：本實(shí)驗(yàn)所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進(jìn)行移液操作時(shí)，移液槍?xiě)?yīng)沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對(duì)著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導(dǎo)致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時(shí)，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動(dòng)的水進(jìn)行沖洗。
（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無(wú)菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過(guò)夜。
注：內(nèi)毒素對(duì)ELISPOT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素的來(lái)源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點(diǎn)的形成，使用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻(xiàn)[1]在培養(yǎng)小鼠細(xì)胞時(shí)使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。
以下過(guò)程1（抗原包被）和2（細(xì)胞培養(yǎng)）必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，過(guò)程3（細(xì)胞因子檢測(cè)）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分泌特異性抗體的B細(xì)胞，該過(guò)程的原理和步驟與細(xì)胞因子ELISPOT測(cè)定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。
（1）準(zhǔn)備無(wú)菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。
注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細(xì)的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問(wèn)題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強(qiáng)其蛋白結(jié)合能力（潤(rùn)濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。
（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇?xì)埩簟?/span>
注：本實(shí)驗(yàn)所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進(jìn)行移液操作時(shí)，移液槍?xiě)?yīng)沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對(duì)著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導(dǎo)致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時(shí)，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動(dòng)的水進(jìn)行沖洗。
（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無(wú)菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過(guò)夜。
注：內(nèi)毒素對(duì)ELISPOT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)毒素的來(lái)源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點(diǎn)的形成，使用無(wú)血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻(xiàn)[1]在培養(yǎng)小鼠細(xì)胞時(shí)使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。
圖4 ELISPOT實(shí)驗(yàn)過(guò)程總覽[2]
（1）棄去抗體包被液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌3次，最后一次棄去液體后，輕輕在無(wú)菌吸水紙上扣干。（2）封閉：每孔加入200 μL含1% BSA的PBS溶液（以0.22 μm濾膜過(guò)濾），室溫封閉2 h。
（3）棄去封閉液，每孔以200 μL無(wú)菌PBS洗滌1次，輕輕在無(wú)菌吸水紙上扣干。（膜板不用時(shí)可在4℃保存數(shù)周）
注：后續(xù)若是使用的是過(guò)往封閉的膜板，每孔可以加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基于室溫下靜置10 min。棄培養(yǎng)基后，重復(fù)該操作一次，再棄培養(yǎng)基，扣干后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。
（4）組別設(shè)計(jì)：① 陰性對(duì)照孔：100 μL培養(yǎng)基+100 μL細(xì)胞；② 細(xì)胞樣品孔：100 μL培養(yǎng)基稀釋的適宜濃度刺激物+100 μL細(xì)胞；③ 陽(yáng)性對(duì)照：100 μL陽(yáng)性對(duì)照刺激物+100 μL細(xì)胞（常用陽(yáng)性對(duì)照刺激物類(lèi)型及濃度見(jiàn)文末附1和2）；④背景對(duì)照孔：不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑。
注1：細(xì)胞加入之后，不宜再震動(dòng)或拍擊ELISPOT板，震動(dòng)或拍擊反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞成圈分布在孔的外周。同時(shí)ELISPOT板之間不能疊放，疊放會(huì)引起整塊板溫度不均勻，導(dǎo)致四周溫度較高的邊緣效應(yīng)。
注2：細(xì)胞狀態(tài)對(duì)ELISPOT檢測(cè)結(jié)果具有重要意義。細(xì)胞狀態(tài)好、活力高、功能保持完整，那么檢測(cè)獲得的結(jié)果必然好。因此在進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)時(shí)要盡可能保證細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于新鮮分離的原代細(xì)胞，需要盡可能減少分離過(guò)程中的機(jī)械損傷以及有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損害。對(duì)于凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞，通常較難保證細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，因此對(duì)細(xì)胞凍存過(guò)程提出了更嚴(yán)格的要求。
圖5 樣品孔設(shè)置舉例（實(shí)驗(yàn)?zāi)康模夯?/span>ELISpot的方法來(lái)測(cè)量小鼠樣品中卵清蛋白特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞）[2]
圖注：Media為培養(yǎng)基＋DMSO，DMSO 濃度和陽(yáng)性對(duì)照終濃度一致；CD4/CD8 epitope是本實(shí)驗(yàn)所用的抗原刺激物。該實(shí)驗(yàn)以Con A（刀豆蛋白）作為陽(yáng)性對(duì)照，CoA是一種非特異性有絲分裂原，理論上可在一定程度上刺激所有樣品，允許我們確認(rèn)所有樣品均含有活細(xì)胞。若陽(yáng)性對(duì)照的響應(yīng)十分強(qiáng)烈，為節(jié)約板空間，不需要對(duì)所有樣品進(jìn)行CoA質(zhì)控。（5）加完所有樣品后，蓋上板蓋，在5%CO2 、37℃條件下培養(yǎng)18-24 h，培養(yǎng)期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。為防止液體蒸發(fā)，96孔板可以使用鋁箔紙包裹。注：板的碰撞或移動(dòng)會(huì)造成細(xì)胞移位，進(jìn)而導(dǎo)致斑點(diǎn)模糊、拖尾、一個(gè)細(xì)胞生成多個(gè)斑點(diǎn)等現(xiàn)象。對(duì)于IFN-γ檢測(cè)通常培養(yǎng)20 h，Th1和Th17細(xì)胞因子培養(yǎng)24 h，Th2細(xì)胞因子和GM-CSF培養(yǎng)48 h，總之要確保每次細(xì)胞因子檢測(cè)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的一致性。
（1）棄去孔內(nèi)的混合培養(yǎng)液，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，在冰浴上孵育10 min。孵育結(jié)束后，每孔用200 μL PBST（含0.05%Tween的PBS溶液）溶液洗滌5次，以除去細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞因子。最后一次棄去液體后，輕輕在吸水紙上扣干。
注：無(wú)菌水孵育的目的在于，利用低滲作用誘導(dǎo)細(xì)胞膨脹和裂解，使其在后續(xù)的洗滌過(guò)程中更容易被去除，否則會(huì)影響最終斑點(diǎn)的形成。（2）每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的二抗（以含0.5%BSA或FCS的PBS稀釋至適宜濃度，并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾），室溫條件下孵育1-2 h。
（3）孵育結(jié)束后，每孔以200 μL PBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時(shí)，將PVDF膜板背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，輕輕在吸水紙上扣干。
注：洗滌膜板背面時(shí)，可以將膜板浸入裝有PBST溶液的容器中，輕輕晃動(dòng)幾次，待膜背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再將其合攏，切忌傷害到膜。該步驟之后，若不立即進(jìn)行斑點(diǎn)顯影檢測(cè)，ELISPOT板可在4℃條件下保存過(guò)夜甚至一周。（4）每孔加入100 μL堿性磷酸酶（ALP）或辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素（streptavidin）或外源性抗生物素蛋白（ExtrAvidin）（以含1%BSA的PBST溶液稀釋?zhuān)?，室溫孵?/span>1 h。
（5）酶底物顯色：每孔加入200 μLPBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時(shí)，將PVDF膜板背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，輕輕在吸水紙上扣干。隨后每孔加入100 μL BCIP/ NBT（用于ALP）或100 μL AEC（用于HRP）顯色液，用鋁箔覆蓋膜板避光。
注：同時(shí)洗滌膜的兩側(cè)可以減少試劑試劑泄露導(dǎo)致的高背景染色。顯色反應(yīng)通常發(fā)生在10-30 min，通過(guò)目視監(jiān)測(cè)斑點(diǎn)的形成過(guò)程。
（6）待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到合適大小，以去離子水洗滌2次，終止顯色反應(yīng)。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30 min，讓膜自然晾干。
注：此處洗滌建議將膜板浸泡在盛滿持續(xù)流動(dòng)水的容器中進(jìn)行，而不是直接利用流動(dòng)的水進(jìn)行沖洗，并且需要同時(shí)洗滌膜板正反面。
（7）將ELISPOT板置于自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)后，進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)并作統(tǒng)計(jì)分析[3]。
注：斑點(diǎn)計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)注意區(qū)分由纖維、膜撕裂、碎片等導(dǎo)致的不規(guī)則斑點(diǎn)，一般細(xì)胞生成的斑點(diǎn)通常為圓形。
附1：實(shí)驗(yàn)所用的刺激物（抗原）類(lèi)型[4]：
① Freeze and Thaw lysate（細(xì)胞凍融產(chǎn)物）
② Class I and Ⅱ Peptides（I類(lèi)和Ⅱ類(lèi)肽）
③ Recombinant proteins（重組蛋白）
④ RNA
⑤ Recombinant virus vectors （重組病毒載體）附2：實(shí)驗(yàn)常用的陽(yáng)性對(duì)照抗原[4]：通刺激物的選擇應(yīng)該遵循“成分盡可能簡(jiǎn)單、純度盡可能高"的原則。特異性刺激物T細(xì)胞表位肽，無(wú)需APC的內(nèi)化和加工，可直接被遞呈給T細(xì)胞，每一條T細(xì)胞表位肽都有相對(duì)應(yīng)的MHC分子，代表了一種特異性的細(xì)胞免疫。但是由于涉及到MHC分子類(lèi)型匹配的問(wèn)題，若不知道實(shí)驗(yàn)對(duì)象的MHC類(lèi)型，可能需要多選擇幾個(gè)T細(xì)胞表位肽，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)效果。其次推薦使用重疊多肽池，在潛在的T細(xì)胞表位肽附近合成一系列的重疊多肽，混合成多肽池，也能對(duì)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答做出有效刺激。國(guó)際上通用的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性刺激物CEF就是這樣一個(gè)T細(xì)胞表位肽池，有32條多肽混合而成，分別取自于人類(lèi)巨細(xì)胞病毒（CMV）、人類(lèi)皰疹病毒（EBV）和流感病毒。其他非特異性刺激物還有植物血凝素（PHA）、脂多糖（LPS）和刀豆蛋白A（ConA）如下圖。
在臨床前研究評(píng)估疫苗佐劑時(shí)，卵清蛋白（OVA）通常被用作模型抗原。原因是：① 單獨(dú)使用時(shí)，OVA具有固有的弱免疫原性；② 不同品系小鼠呈遞的OVA抗原表位目前已經(jīng)清晰。
圖注：來(lái)自免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ+斑點(diǎn)形成細(xì)胞。C57BL/6小鼠在第0天和第21天單獨(dú)用OVA（10 μg）或聯(lián)合明礬（40 μg）+ CpG 1826（10 μg）佐劑進(jìn)行肌肉注射誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在第28天收集脾細(xì)胞，用IFN-γ ELISpot分析OVA特異性CD4 T細(xì)胞。代表性結(jié)果如圖a-d。a, b：經(jīng)OVA免疫后分離的小鼠細(xì)胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR（CD4 Epitope）進(jìn)行刺激。c, d：經(jīng)OVA+明礬/CpG聯(lián)合免疫后分離的小鼠細(xì)胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR進(jìn)行刺激。
ELISPOT評(píng)價(jià)T細(xì)胞功能注意事項(xiàng)
在前面的實(shí)驗(yàn)步驟中，我已經(jīng)盡可能羅列了各步操作中應(yīng)當(dāng)注意的事項(xiàng)，在此根據(jù)文獻(xiàn)[5]對(duì)相關(guān)內(nèi)容再做補(bǔ)充，希望幫助大家拿下這個(gè)實(shí)驗(yàn)。
（1）血液樣本：血樣收集時(shí)推薦使用肝素抗凝，EDTA-K2抗凝時(shí)會(huì)對(duì)部分酶產(chǎn)生抑制作用，尤其可以抑制ALP酶活（EDTA螯合了ALP酶活性所需要的Mg2+）。（2）血樣儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)移：建議在室溫避光條件下儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)血樣，如此可維持PBMC中CD4和CD8細(xì)胞功能至少24 h（活性在90%以上）。（3）培養(yǎng)基：切忌使用未經(jīng)測(cè)試的血清。血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點(diǎn)的形成。因此建議使用ELISPOT專(zhuān)用的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、洗滌以及其它相關(guān)操作。（4）細(xì)胞儲(chǔ)存：細(xì)胞梯度冷卻后應(yīng)在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮中保存。即使是短期儲(chǔ)存，也不建議將細(xì)胞保存在-80℃，否則會(huì)引起細(xì)胞功能逐漸喪失。（5）PBMC過(guò)夜培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：重新復(fù)蘇的PBMC給予過(guò)夜培養(yǎng)，有助于細(xì)胞功能恢復(fù)。細(xì)胞數(shù)目會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可變性，臺(tái)盼藍(lán)染色法在該實(shí)驗(yàn)中存在不足：該染色會(huì)將部分凋亡的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)在內(nèi)，但是這部分細(xì)胞在后續(xù)進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)會(huì)。染料應(yīng)當(dāng)能夠準(zhǔn)確區(qū)分活、死和凋亡細(xì)胞，反映PBMC樣本的總體質(zhì)量。有必要時(shí)PBMC可經(jīng)DNase洗滌除亡細(xì)胞釋放的DNA裂解物，提高計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。（6）乙醇預(yù)潤(rùn)濕PVDF膜：理論上只有疏水性低的單克隆抗體（PVDF膜疏水性）才需要乙醇預(yù)潤(rùn)濕，部分疏水性抗體無(wú)需該步驟。預(yù)潤(rùn)濕可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的膜泄露，以及增加額外的實(shí)驗(yàn)步驟，因此針對(duì)部分抗體建議測(cè)試乙醇預(yù)潤(rùn)濕對(duì)分析結(jié)果性能的影響。
（7）每孔細(xì)胞數(shù)：如果抗原特異性T細(xì)胞頻率未知，推薦以3-5×105細(xì)胞/孔作為起始數(shù)目。在1-8×105細(xì)胞/孔的范圍內(nèi)，加入的細(xì)胞數(shù)與形成的斑點(diǎn)數(shù)具有良好的線性關(guān)系，實(shí)際可根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。此外，由于臨床樣本的珍貴性，PBMC以105細(xì)胞/孔設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，可以幫助獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果。
注：如有必要，可通過(guò)滴定來(lái)確定ELISPOT實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞密度，以獲得特定組織類(lèi)型來(lái)源細(xì)胞的最佳斑點(diǎn)分離效果。文獻(xiàn)[1]給出了一些常見(jiàn)細(xì)胞的推薦使用濃度。在使用純化的T淋巴細(xì)胞或者每孔細(xì)胞數(shù)少于106時(shí)，推薦在活化期間加入額外的飼養(yǎng)層細(xì)胞（比如脾細(xì)胞）或抗原提呈細(xì)胞（APC），前提是確保加入這些細(xì)胞有效。特定組織每孔細(xì)胞常用濃度為：
①小鼠引流淋巴結(jié)細(xì)胞：0.5×106細(xì)胞/孔②小鼠脾細(xì)胞：0.5-1×106細(xì)胞/孔③小鼠腦來(lái)源的單核細(xì)胞（在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中，EAE研究）：2-5×104細(xì)胞/孔④小鼠T細(xì)胞系：500或1000細(xì)胞/孔⑤小鼠T細(xì)胞單克隆系：250-1000細(xì)胞/孔⑥小鼠APCs：脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞：0.5×106細(xì)胞/孔；B細(xì)胞：4×104細(xì)胞/孔⑦人PBMCs：0.5-1×106細(xì)胞/孔⑧人T細(xì)胞系：1-2×104細(xì)胞/孔
⑨人APCs：自體PBMCs 0.5×106細(xì)胞/孔
（8）添加APC：PBMC中含有豐富的能夠刺激T細(xì)胞的APC。巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及DC細(xì)胞具有類(lèi)似的刺激作用。雖然DC細(xì)胞的活化速度更快，單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子量更多，但是這些差異在培養(yǎng)24 h后基本消失。因此，對(duì)于常規(guī)的ELISPOT分析，額外添加DC細(xì)胞作為APC對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響可能不大，但卻大大增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性。因此建議對(duì)額外添加DC細(xì)胞的效果進(jìn)行驗(yàn)證，減少后續(xù)不必要的操作。
（9）DMSO濃度控制：大多數(shù)I類(lèi)MHC限制性肽是疏水性的，需要用DMSO助溶，超過(guò)0.5%濃度的DMSO對(duì)淋巴細(xì)胞，尤其是活化的淋巴細(xì)胞有毒。
