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生物素?；结樀臋z測(cè)實(shí)驗(yàn)
與放射性標(biāo)記探針的比活不同，生物素標(biāo)記探針的可檢出性在于每千堿基對(duì)中摻入的生物素分子的數(shù)量，它可用比色法檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)方法
- 比色法
- 化學(xué)發(fā)光法
| 實(shí)驗(yàn)材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 磷酸酶緩沖液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) 分光光度計(jì) 搖床 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 用DNA稀釋緩沖液，稀釋生物素?；瘶?biāo)準(zhǔn)DNA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測(cè)DNA。 2. 對(duì)干硝酸纖維素濾膜：每個(gè)稀釋度取1 μl 點(diǎn)膜，在80℃供干約1 h接步驟4。 3. 對(duì)于足龍膜：每個(gè)稀釋度取1 μl 點(diǎn)膜，晾干后用紫外照射法將DNA交聯(lián)至膜上。接步驟4或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。 4. 用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大小），用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。 5. 稀釋10 μl 親和素-AP交聯(lián)物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯(lián)物代替，重新封口，在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)室溫?fù)e蕩10 min。 6. 從袋中取出濾膜移到一個(gè)淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖蕩。 7. 加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混勻。 8. 在淺盤中避光溫育溶液，不時(shí)觀察直至發(fā)色達(dá)到滿意程度為止。 9. 加TE pH8.0以終止反應(yīng)，比較測(cè)定DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)DNA的顏色強(qiáng)度以確定生物素?；痙NTP的摻入效率。如果該探計(jì)至少有一半標(biāo)準(zhǔn)品的強(qiáng)度，它可作為探針用于原位雜交。 |
