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快速掌握PCR儀的使用秘籍
閱讀：1483發(fā)布時間：2021-5-18
PCR儀利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。
PCR儀的操作規(guī)程：
過去標準的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下：
(1)向一微量離心管中依次加入
DNA模板 102-105拷貝
引物 各1μmol/L
dNTP 各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積(終體積50μl-100μl)
混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
(2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
(3)冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
(4)PCR儀的循環(huán)程序為：94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。然后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。
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