基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）ELISA

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基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）ELISA

定量測定

ELISA操作步驟復雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的*，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)值，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是較理想的檢測區(qū)域。

測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān)。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線注意圖中橫坐標為對數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達。

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）ELISA

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入標準品50μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

5.   測定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

6.   根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。