小翊君前幾期一直在和大家聊qPCR，今天我們開(kāi)啟一個(gè)新的話(huà)題，聊一聊反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）定義:

反轉(zhuǎn)錄過(guò)程簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程，是對(duì)中心法則的重要修正和補(bǔ)充。
 

中心法則

    通常會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)不同的表述，逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄，二者的本質(zhì)區(qū)別在于：反轉(zhuǎn)錄是在研究過(guò)程中人為提取RNA并以之為模板人工合成DNA的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄是RNA病毒自主行為，以RNA為模板形成DNA的過(guò)程。前者發(fā)生在體外，后者發(fā)生在體內(nèi)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的示意圖如下圖所示：
 

反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程

   看似簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，但也受到多種因素的影響，如模板、引物、酶以及反應(yīng)條件等。接下來(lái)小編將帶您對(duì)其各個(gè)擊破。

一、模板
 

① RNA自身結(jié)構(gòu)（高GC、復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)）

RNA由于自身序列折疊，具有不同復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)：配對(duì)的雙鏈RNA呈螺旋，發(fā)卡環(huán)，突環(huán)，內(nèi)環(huán)，多分支環(huán)等結(jié)構(gòu)。由于配對(duì)堿基不同，其配對(duì)的穩(wěn)性也不同，如G與C之間的配對(duì)，三對(duì)氫鍵，為穩(wěn)定。A與U為兩對(duì)氫鍵相互作用；G與U為一對(duì)氫鍵相互作用，不穩(wěn)定。故對(duì)于RNA模板來(lái)講，GC含量越高，二級(jí)結(jié)構(gòu)越為復(fù)雜。

在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，如下圖所示，當(dāng)引物延伸到有二級(jí)結(jié)構(gòu)的地方，反應(yīng)就會(huì)被迫終止，影響cDNA的合成長(zhǎng)度。此時(shí)可建議先將模板進(jìn)行65℃孵育5min然后迅速冰上冷卻使二級(jí)結(jié)構(gòu)變性；同時(shí)可通過(guò)在較高的溫度下（如55℃）反應(yīng)以降低RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。
 

反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)延伸過(guò)程

② 純度和濃度的測(cè)定
 

RNA純度會(huì)很大程度地影響反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，如RNA純化過(guò)程中混入的鹽、金屬離子、乙醇、苯酚等均是常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。此外植物組織中的多糖多酚和腐殖酸等也會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶造成抑制作用。

對(duì)于RNA純度的測(cè)定，通常會(huì)選用Nano drop進(jìn)行測(cè)定。純度完好的RNA：1.8＜OD260/OD280＜2.0（＜1.8時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染，可增加酚抽提；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）；OD260/OD230應(yīng)大于2。（＜2表明有異硫氰酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留；可進(jìn)行再次沉淀，重復(fù)乙醇洗滌）。

對(duì)于RNA濃度的測(cè)定，通常也會(huì)選用Nano drop進(jìn)行測(cè)定。

③ 完整度
 

RNA的完整度在很大程度上影響著cDNA合成的長(zhǎng)度與質(zhì)量。在進(jìn)行RNA提取處理儲(chǔ)存和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要采取特殊的保護(hù)措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用無(wú)RNA酶污染的實(shí)驗(yàn)耗材等。

對(duì)于下游的克隆實(shí)驗(yàn)，RNA完整度將會(huì)影響cDNA的合成長(zhǎng)度，從而影響目的基因的合成。對(duì)于下游的目的基因定量實(shí)驗(yàn)，將會(huì)嚴(yán)重影響其CT值，從而影響定量結(jié)果度（見(jiàn)下圖）。
 

RNA RIN值和CT值的關(guān)系

     RNA的完整度通常會(huì)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于28S和18S rRNA的比值來(lái)評(píng)估RNA的完整度，接近2:1為較為完整的RNA。

目前，Agilent 2100生物分析儀已逐漸成為RNA樣品質(zhì)量控制（QC）的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在分析RNA完整性之后給出準(zhǔn)確的數(shù)值（RIN值），該值在8-10之間表示RNA質(zhì)量非常好，小于7時(shí)表示RNA完整度較差。

④ gDNA的去除
 

在進(jìn)行下游qPCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性。因此在反轉(zhuǎn)錄之前必須要對(duì)RNA模板進(jìn)行去gDNA處理，保證模板中僅有cDNA。

那么如何解決呢？

我們可通過(guò)加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前需將DNaseⅠ滅活（通過(guò)高溫加熱或加入EDTA），否則該酶會(huì)將cDNA降解，但是高溫滅活DNaseⅠ會(huì)造成RNA的降解和損失，加入EDTA滅活又會(huì)引入新的RNA酶抑制劑。

Yeasen生物提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒含gDNA digester組分，在反轉(zhuǎn)錄之前可將其與RNA模板混勻42℃，2min即可去除gDNA組分，同時(shí)此試劑盒中的SuperMix 可終止gDNA digester的作用，保證cDNA的完整性。

二、引物
 

① Oligo(dT)

    Oligo(dT)引物是約12-18個(gè)多聚胸腺嘧啶T組成的重復(fù)寡核苷酸序列，能夠特異性地與真核生物mRNA的ploy(A)尾退火，故不適合缺少ploy(A)尾結(jié)構(gòu)的RNA，如原核生物RNA或microRNA，也不適用于已降解的RNA，如FFPE樣品中RNA。

真核生物中mRNA僅占總RNA的1%-5%左右，通常在進(jìn)行從真核生物中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，或者克隆全長(zhǎng)cDNA以及3’RACE等研究時(shí)會(huì)優(yōu)先選擇 Oligo(dT)引物。

對(duì)于復(fù)雜模板RNA，如含較多二級(jí)結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行cDNA的合成延伸過(guò)程中，當(dāng)延伸到二級(jí)結(jié)構(gòu)處時(shí)，可能會(huì)造成延伸終止，若選擇Oligo(dT)可能會(huì)造成mRNA 5’端信息的丟失。

② Random N6-N9
 

隨機(jī)引物是由隨機(jī)堿基組成的寡核苷酸，通常由6個(gè)核苷酸組成，稱(chēng)為隨機(jī)6聚體。該種引物不具備特異性，rRNA, tRNA,非編碼RNA，小RNA，降解RNA，復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA等都可以作為其模板。該類(lèi)引物可提高cDNA的產(chǎn)量和濃度，但是會(huì)使合成的cDNA長(zhǎng)度變短。

③ 基因特異性引物
 

基因特異性引物能夠與模板特異性互補(bǔ)，產(chǎn)生目標(biāo)性很強(qiáng)的cDNA，對(duì)于后續(xù)的PCR擴(kuò)增更特異，適用于已知目的序列。通常應(yīng)用于一步RT-PCR反應(yīng)。當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）無(wú)法有效合成鏈cDNA時(shí)，可選用Oligo(dT)或隨機(jī)引物。

三、酶
 

不同的逆轉(zhuǎn)錄酶具有不同的功能活性，表現(xiàn)出不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，如合成cDNA的長(zhǎng)度，產(chǎn)量，對(duì)復(fù)雜模板的適應(yīng)程度等。通常共有的活性如下：

1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合形成DNA的過(guò)程。

2）RNaseH活性：在反應(yīng)過(guò)程中切割RNA：cDNA雜合鏈中的RNA模板。降低此活性，可避免在合成較長(zhǎng)cDNA之前模板RNA被降解掉。

3）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的條cDNA單鏈為模板，再合成第二條cDNA分子。

4）熱穩(wěn)定性：此性能是影響cDNA合成的重要因素。升高反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的溫度，有助于高GC或復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA模板的變性，實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA的合成。

5）保真性：RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA過(guò)程中的序列度。由于逆轉(zhuǎn)錄酶不具備3’-5’外切酶活性，因此沒(méi)有校正功能，所以合成的cDNA出錯(cuò)率較高。通常，除測(cè)序?qū)Χ纫筝^高外，其他情況下，反轉(zhuǎn)錄中引入的錯(cuò)誤數(shù)量可忽略不計(jì)，因?yàn)閏DNA中的錯(cuò)誤不會(huì)被放大。

6）抗抑制能力：當(dāng)模板純度較低、抑制物較多時(shí)，抗抑制能力強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶才能正常進(jìn)行cDNA的合成。

目前使用的逆轉(zhuǎn)錄酶大都為MMLV（來(lái)源于莫洛尼鼠白血病病毒）。未經(jīng)改造的MMLV適反應(yīng)溫度為37℃，有較低的RNaseH活性。Yeasen生物對(duì)MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行改造，提高其適反應(yīng)溫度（高溫下有利于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開(kāi)），降低RNaseH活性，提高cDNA合成長(zhǎng)度，增強(qiáng)其靈敏度和耐抑制能力。改造結(jié)果見(jiàn)下圖：

 

逆轉(zhuǎn)錄酶的改造

各種逆轉(zhuǎn)錄酶的性能參數(shù)如下表：
 

反應(yīng)過(guò)程
 

反轉(zhuǎn)錄溫度通常推薦使用42℃，對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到50℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存；若需長(zhǎng)期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

總之，率的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)建立在高質(zhì)量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶，合適的引物，適宜的反應(yīng)條件等基礎(chǔ)上的。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意到所有的影響因素，才能合成出適用于下游實(shí)驗(yàn)的高質(zhì)量cDNA。

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