探秘細(xì)胞凋亡過程

                                                       ——實(shí)用檢測(cè)方法盤點(diǎn)

>>>背景

圖1：細(xì)胞凋亡與壞死過程

 
      細(xì)胞壞死（necrosis）是因?yàn)椴±矶a(chǎn)生的被動(dòng)死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大、胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)等。       
       細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡（Apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡過程， 細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

表一：細(xì)胞凋亡與細(xì)胞死亡的區(qū)別

表二：細(xì)胞凋亡的不同檢測(cè)方式
 

>>>探秘細(xì)胞凋亡，抓重點(diǎn)、找方法
      細(xì)胞處于不同的凋亡階段需要找到不同的特點(diǎn)，配以合適的檢測(cè)工具就能準(zhǔn)確解讀細(xì)胞凋亡的密碼。凋亡的細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特征，典型的特征包括：1）細(xì)胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻；2）線粒體膜電位喪失；3）細(xì)胞核濃縮和斷裂

>>>凋亡早期檢測(cè)

      在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS由細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

圖2：Annexin-V 檢測(cè)早期凋亡原理示意圖

>>>線粒體膜電位變化的檢測(cè)

       線粒體膜電位（△Ψm ）的丟失導(dǎo)致線粒體膜中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，細(xì)胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細(xì)胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位（△Ψm ）的理想熒光探針，表現(xiàn)出電勢(shì)依賴性的積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞中，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化將直接反映出線粒體膜電位的變化。

圖3：JC-1檢測(cè)熒光與流式結(jié)果示意圖（圖片源自科學(xué)網(wǎng)）

>>>凋亡晚期檢測(cè)

        細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3’--OH末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）

圖4：TUNEL法檢測(cè)原理示意圖

>>>客戶使用數(shù)據(jù)展示
 Annexin-V檢測(cè)

(a-2, b-2) 100 μg/ml AuNCs@L-GSH 處理24h，(a-3, b-3) 100 μg/ml AuNCs@D-GSH 處理24h，(a-1, b-1) 無處理。

檢測(cè)試劑：Cat No. 40302 Annexin-V -FITC/PI檢測(cè)流式分析早期凋亡

JC-1檢測(cè)

上象限中顯示去極化細(xì)胞的百分比；柱狀圖代表正常細(xì)胞，去極化細(xì)胞和壞死細(xì)胞的平均比例

檢測(cè)試劑：Cat No. 40705 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位改變.

Tunel檢測(cè)

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L凋亡檢測(cè)。行代表陰性對(duì)照，第二行代表陽性對(duì)照

檢測(cè)試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）

檢測(cè)試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

>>>已使用客戶發(fā)表文章引用

Annexin V

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JC-1 or JC-10

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TUNEL

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>>>附上小編一些檢測(cè)實(shí)驗(yàn)TIP

AnnexinV/PI檢測(cè)

Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測(cè)除人以外其他動(dòng)物細(xì)胞凋亡情況？
A：可以。因?yàn)锳nnexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結(jié)合，而PS不存在種屬間差異。

Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)，用含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞對(duì)結(jié)果有影響嗎？
A：會(huì)。因?yàn)锳nnexin V 是Ca2+ 依賴的蛋白，EDTA會(huì) 螯合Ca2+從而影響Annexin V與PS 的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：如果細(xì)胞自帶GFP蛋白，請(qǐng)問哪種凋亡檢測(cè)試劑盒適用該細(xì)胞的凋亡檢測(cè)？
A：選用PE標(biāo)記或者APC標(biāo)記的Annexin V凋亡檢測(cè)試劑。

Q：對(duì)于來自血液的細(xì)胞樣品，為什么去除血液中的血小板？
A：因?yàn)檠“逯泻蠵S，其能與Annexin V結(jié)合進(jìn)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：Annexin -V 在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？
A：由于Annexin -V染料上帶有熒光基團(tuán)，在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育；為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性應(yīng)在染色后1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

TUNEL檢測(cè)

Q：組織切片厚度多少比較合適？
A：組織切片過厚，會(huì)使得固定效果不理想，*控制在10μm以內(nèi)。

Q：除了Paraformaldehyde固定，可不可以使用甲醇固定？
A：使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。酸性固定液，也容易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。建議采用新鮮配置的4%中性Paraformaldehyde固定液。

Q：如何避免出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記？
A：（1）對(duì)于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細(xì)胞，例如平滑肌細(xì)胞，建議取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
      （2）在進(jìn)行末端標(biāo)記的時(shí)候，保證細(xì)胞或組織表面保持濕潤，檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
Q：Tunel檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)操作上有哪些注意事項(xiàng)？
A：熒光基團(tuán)長期暴露在普通光照下，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重淬滅，因此在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)盡量避光操作和孵育。
 

熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)

Q：光補(bǔ)償調(diào)節(jié)的原則？
A: 1）用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臉颖颈仨殕稳尽?/span>
2）用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒晒馑乇仨毰c實(shí)驗(yàn)用的熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)EGFP的補(bǔ)償）。
2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如圖所示），但在實(shí)際操作中，只需要保證單染的細(xì)胞不跨區(qū)存在。

Q：如何進(jìn)行光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)？
A：進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，需要設(shè)置幾組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例；
1）空白對(duì)照組：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，用于電壓的調(diào)節(jié)，調(diào)整前向散射和側(cè)向散射，得到清晰劃分的細(xì)胞群體。
2）凋亡誘導(dǎo)的單染組：陽性對(duì)照的細(xì)胞群體需要超過分析的細(xì)胞群體的10%，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
3）雙染實(shí)驗(yàn)組：利用空白對(duì)照組和單染組調(diào)節(jié)好的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得。

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