揭秘各種主流二代測(cè)序儀，無(wú)瓜攻略

隨著基因領(lǐng)域研究的不斷深入，自sanger測(cè)序?qū)崿F(xiàn)對(duì)堿基信息的可讀取后，更高通量的需求使得二代測(cè)序在基因組測(cè)序、臨床檢測(cè)和生物制藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出的潛力。

對(duì)于剛?cè)胄械男』锇?，面?duì)各式各樣的測(cè)試平臺(tái)好奇又迷茫，Roche454、Illumina、Thermo Fisher，以及國(guó)產(chǎn)MGI平臺(tái)等，這么多測(cè)序儀，他們的特點(diǎn)是什么？背后的發(fā)展歷程是怎樣的？

今天小翊借花獻(xiàn)佛，梳理了目前主流的二代測(cè)序平臺(tái)，讓我們了解二代測(cè)序這十幾年的發(fā)展歷程。

表1二代測(cè)序部分儀器展示

備注：圖片來(lái)源于各儀器品牌關(guān)網(wǎng)和網(wǎng)絡(luò)

羅氏454 GS測(cè)序系統(tǒng)——昔日的輝煌

二代測(cè)序于2005年初登舞臺(tái)，454公司基于焦磷酸測(cè)序法推出了Genome Sequencer 20 System(GS 20)系統(tǒng)，開(kāi)啟了邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis）高通量測(cè)序的進(jìn)程。2007年，羅氏公司收購(gòu)了454，并推出了一系列性能更優(yōu)的NGS系統(tǒng)，極大的提升測(cè)序通量和準(zhǔn)確性，也進(jìn)一步增加了測(cè)序讀長(zhǎng)。雖然羅氏454具有讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但是測(cè)序通量和成本始終限制了454平臺(tái)的推廣，因此羅氏在2016年底終止了454 NGS測(cè)序相關(guān)的業(yè)務(wù)。

表2羅氏454 GS測(cè)序儀器參數(shù)對(duì)比

備注：數(shù)據(jù)來(lái)源于羅氏關(guān)網(wǎng)和網(wǎng)絡(luò)

二、Illumina測(cè)序儀——測(cè)序界的巨鱷

2006年，Solexa公司推出了Genome Analyzer系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱GA），其包括DNA簇（DNA cluster）、橋式PCR（Bridge PCR）和可逆阻斷（Reversible terminator）等核心技術(shù)，這使得GA系統(tǒng)在高通量、低成本、應(yīng)用范圍廣等方面具有明顯優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司收購(gòu)了Solexa，并在隨后幾年間發(fā)布了多種測(cè)序儀，主要包括兩類：低通量的桌面式測(cè)序儀和高通量臺(tái)式測(cè)序儀，基本覆蓋行業(yè)內(nèi)的各種測(cè)序應(yīng)用，目前占據(jù)的測(cè)序*超8成。

1、Illumina HiSeq系列

  HiSeq系列由Illumina公司2010年推出，該系列非常適合全基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。2014年1月，Illumina宣布推出HiSeq X Ten測(cè)序平臺(tái)，適用于大規(guī)模人群分析，包括10個(gè)可平行測(cè)序的超高通量測(cè)序儀，此系統(tǒng)號(hào)稱為第-個(gè)將人類全基因組測(cè)序成本降至1000美元或更低的測(cè)序平臺(tái)。

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測(cè)序原理：利用可逆性末端邊合成邊測(cè)序技術(shù)、四通道成像技術(shù)，每輪測(cè)序反應(yīng)中存在4種核苷酸。

儀器特點(diǎn)：該系列儀器成本低，靈活性高，通量大。缺點(diǎn)是讀長(zhǎng)短和對(duì)每個(gè)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和分析系統(tǒng)不足。

應(yīng)用領(lǐng)域：Hiseq2500適合大規(guī)模基因組學(xué)，Hiseq3000/4000適合生產(chǎn)級(jí)模板的基因組學(xué)，Hiseq X Five適合生產(chǎn)級(jí)規(guī)模的人類全基因組測(cè)序，Hiseq X Ten適合群體規(guī)模的測(cè)序。總體來(lái)說(shuō)，Hiseq系列適合全基因組測(cè)序、靶向重測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、de novo測(cè)序、表觀遺傳調(diào)控等。

2、Illumina MiSeq

    MiSeq系列由Illumina公司2011年推出，與Hiseq分享主要的核心技術(shù)，但是體積和通量更小、價(jià)格低，Miseq更佳便于擴(kuò)增子和細(xì)菌樣本測(cè)序，更佳適合臨床使用。

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測(cè)序原理：可逆性末端邊合成邊測(cè)序技術(shù)、四通道成像技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：易于操作，體積小巧，可進(jìn)行雙向擴(kuò)增子測(cè)序，樣本制備簡(jiǎn)易，具有2x300 bp的讀長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)高達(dá)15 Gb的產(chǎn)出。缺點(diǎn)是不適合WGS和WES測(cè)序。

應(yīng)用領(lǐng)域：MiSeq系列快速簡(jiǎn)約，適合小型全基因組測(cè)序（微生物、病毒）、靶向基因測(cè)序（擴(kuò)增子、基因集合）、16S宏基因組測(cè)序、靶向基因表達(dá)譜、長(zhǎng)片段擴(kuò)增子測(cè)序、DNA-蛋白互作分析及miRNA和小RNA分析等。

3、Illumina Nextseq 500

Nextseq 500是Illumina公司于2014年推出的一款高通量臺(tái)式測(cè)序儀，其大小與Miseq相當(dāng)，性能卻與Hiseq相當(dāng)。

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測(cè)序原理：改良型邊合成邊測(cè)序（兩通道SBS）化學(xué)原理。

儀器特點(diǎn)：運(yùn)行時(shí)間短、測(cè)序質(zhì)量高，全基因組、外顯子和RNA測(cè)序可在一個(gè)平臺(tái)完成，改良型技術(shù)效率更高。

應(yīng)用領(lǐng)域：適合大型全基因組測(cè)序（人類、植物、動(dòng)物）、小型全基因組測(cè)序（微生物、病毒）、外顯子組測(cè)序、靶向基因測(cè)序（擴(kuò)增子、基因集合）、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因表達(dá)譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測(cè)序和16S宏基因組測(cè)序。

4、Illumina MiniSeq

MiniSeq 是Illumina公司于2016年1月發(fā)布的一款小型桌面式測(cè)序儀，體積比Miseq儀器小44%。

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測(cè)序原理：可逆性末端邊合成邊測(cè)序技術(shù)、雙通道成像技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：運(yùn)行時(shí)間短、選擇靈活，測(cè)序質(zhì)量更高。缺點(diǎn)是不適合WGS和WES測(cè)序。

應(yīng)用領(lǐng)域：適合大型全基因組測(cè)序（人類、植物、動(dòng)物）、小型全基因組測(cè)序（微生物、病毒）、外顯子組測(cè)序、靶向基因測(cè)序（擴(kuò)增子、基因集合）、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因表達(dá)譜（mRNA-Seq）、miRNA和小RNA分析、DNA-蛋白互作分析、甲基化測(cè)序和16S宏基因組測(cè)序。

5、Illumina NovaSeq系列

NovaSeq系列是Illumina公司于2017年1月發(fā)布的可擴(kuò)展的高通量測(cè)序儀，該系列有5000和6000兩種系統(tǒng)，并且具有可選擇的不同數(shù)量流動(dòng)槽芯片的測(cè)序模式。

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測(cè)序原理：可逆性末端邊合成邊測(cè)序技術(shù)、整合了圖案化流動(dòng)槽技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：可擴(kuò)展、通量高、選擇靈活、簇密度和產(chǎn)出更高。

應(yīng)用領(lǐng)域：使用范圍廣，以上4種類型儀器的測(cè)序領(lǐng)域均可覆蓋。

Illumian公司系列測(cè)序儀參數(shù)對(duì)比如表3所示：

表3 Illumina測(cè)序儀器參數(shù)對(duì)比

備注：數(shù)據(jù)來(lái)源于Illumina關(guān)網(wǎng)

三、Thermo Fisher體系測(cè)序儀——測(cè)序的聯(lián)合王國(guó)

2008年ABI與Invitrogen合并成為L(zhǎng)ife technologies公司，2010年8月，Life Technologies將Ion Torrent收購(gòu)，2013年，Life Technologies被Thermo Fisher收購(gòu)，借此Thermo Fisher正式入駐測(cè)序行業(yè)，旗下測(cè)序體系包括ABI SOLID和Ion-Proton兩種平臺(tái)。

1、ABI SOLID

ABI在收購(gòu)了Agencourt Personal Genomics測(cè)序公司后，推出了SOLiD™ 5500和SOLiD™ 5500xl新一代測(cè)序儀，為廣大科研工作者提供更為全面的NGS服務(wù)解決方案。

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測(cè)序原理：微乳滴PCR與微球相結(jié)合的策略來(lái)擴(kuò)增DNA模板，并在測(cè)序過(guò)程中對(duì)堿基間隔反復(fù)的讀取，拼接合成后終獲得整條模板片段的完整序列信息。

儀器特點(diǎn)：測(cè)序通量已達(dá)到45Gb/天，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且SOLiD系統(tǒng)對(duì)于高GC含量的樣本，也具有非常大的優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是讀長(zhǎng)較短，測(cè)序時(shí)間長(zhǎng)。

應(yīng)用領(lǐng)域：全基因組測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、微生物測(cè)序、數(shù)字核型分析、臨床測(cè)序、基因型分析、基因表達(dá)分析和小分子RNA的發(fā)現(xiàn)等等。

2、Ion PGM

Life Technologies公司于2010年推出了半導(dǎo)體個(gè)人化操作基因組測(cè)序儀Ion PGM™，主要用于小基因組和外顯子的測(cè)序。

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測(cè)序原理：基于離子半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)堿基摻入過(guò)程中釋放氫離子，不用熒光、化學(xué)發(fā)光和酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)高敏的離子傳感器獲得信號(hào)數(shù)據(jù)。

儀器特點(diǎn)：樣本消耗少，準(zhǔn)確性達(dá)到99.97%，提供3種芯片測(cè)序，流程簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是讀長(zhǎng)短，不利于基因組de nova組裝，并且對(duì)于單堿基重復(fù)序列準(zhǔn)確率不高。

應(yīng)用領(lǐng)域：小基因組測(cè)序（如微生物和病毒的從頭測(cè)序和重測(cè)序，線粒體測(cè)序等）、擴(kuò)增子重測(cè)序（16S宏基因組測(cè)序）、靶基因組測(cè)序、基因組/全外顯子驗(yàn)證等。

3、Ion Proton

Life Technologies公司于2012年宣布在中國(guó)推出新的臺(tái)式基因測(cè)序儀Ion Proton system，旨在一天內(nèi)完成人類基因組測(cè)序。Ion Proton™測(cè)序儀采用了新一代半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，且芯片密度比Ion PGM™測(cè)序儀高1000倍，運(yùn)行速度更快，單位時(shí)間的通量更高。

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測(cè)序原理：離子半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：測(cè)序時(shí)長(zhǎng)更短，兩種通量芯片可供選擇，單次可產(chǎn)生10-15Gb數(shù)據(jù)量，支持條形碼讀取并完成單片96個(gè)樣本的測(cè)序。缺點(diǎn)是原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性相對(duì)不高，讀長(zhǎng)較多，平均大讀長(zhǎng)為200bp。

應(yīng)用領(lǐng)域：適用于外顯子（構(gòu)成蛋白質(zhì)的基因片段）測(cè)序，以及人類或植物基因組圖譜繪制等大型測(cè)序工程。

4、Ion S5/S5xl

2015年10月推出了Ion S5和IonS5 xl，適用于靶向測(cè)序。該系統(tǒng)將多個(gè)gene panel和小的基因組集合起來(lái)，并簡(jiǎn)化操作流程和動(dòng)手在操作時(shí)間，目前支持4種不同的芯片類型。

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測(cè)序原理：離子半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：運(yùn)行速度更快，需要樣本少，不同通量的芯片可選。缺點(diǎn)是讀長(zhǎng)較短，數(shù)據(jù)分析工具和途徑較少。

應(yīng)用領(lǐng)域：可應(yīng)用于癌癥、遺傳病、液體活檢、感染性疾病領(lǐng)域。使用于靶向RNA和DNA測(cè)序，微生物、轉(zhuǎn)錄組、外顯子組和RNA-seq。

Thermo Fisher體系測(cè)序儀參數(shù)對(duì)比如表4所示：

表4 Thermo Fisher體系測(cè)序儀器參數(shù)對(duì)比

備注：數(shù)據(jù)來(lái)源于Thermo Fisher關(guān)網(wǎng)和網(wǎng)絡(luò)

四、華大智造測(cè)序儀——測(cè)序?qū)玫男沦F

2013年3月18日，華大基因?qū)G(Complete Genomics)公司全額收購(gòu)，開(kāi)啟了華大測(cè)序儀之路。歷經(jīng)兩年的研發(fā)和改進(jìn)，華大基因推出了BGISEQ-500桌面化測(cè)序系統(tǒng)。之后又推出的BGISEQ-50、MGISEQ-200和MGISEQ-2000均取得了CFDA認(rèn)證，還推出了MGISEQ-T7，華大測(cè)序體系得到了從8G到6T通量的覆蓋，應(yīng)用領(lǐng)域也得到了極大的拓展。

1、Revolocity

2015年6月推出了一款*集成式的“超級(jí)測(cè)序儀”——Revolocity測(cè)序儀，該系統(tǒng)一年可完成10000-30000個(gè)全基因組測(cè)序，也支持全外顯子測(cè)序。

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測(cè)序原理：cPAL技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：適用于大規(guī)模WGS和WES，50ⅹ深度基因組測(cè)序僅需8天，50ⅹ深度下對(duì)人類基因組測(cè)序拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異為96%，模塊化處理全血和唾液用時(shí)少。缺點(diǎn)是目前于人類全基因組測(cè)序。

應(yīng)用領(lǐng)域：全基因組測(cè)序和全外顯子測(cè)序。

2、BGISEQ-500

2015年華大基因推出了新型桌面化測(cè)序系統(tǒng)BGISEQ-500。

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測(cè)序原理：以cPAL技術(shù)和改進(jìn)的DNA納米球技術(shù)為核心技術(shù)。

儀器特點(diǎn)：85%以上的數(shù)據(jù)高于Q30標(biāo)準(zhǔn)，多讀長(zhǎng)選擇，雙芯片平臺(tái)，全自動(dòng)文庫(kù)制備系統(tǒng)和全自動(dòng)樣本加載系統(tǒng)，目前應(yīng)用于中國(guó)大陸地區(qū)。

應(yīng)用領(lǐng)域：NIPT、PGS、PM-Seq、染色體異常檢測(cè)、WGS、WES、RNA-seq（定量）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、ChIP-Seq、small RNA等。

華大智造測(cè)序儀參數(shù)對(duì)比如表5所示：

表5 華大智造測(cè)序儀器參數(shù)對(duì)比

五、小結(jié)

羅氏454則在長(zhǎng)讀長(zhǎng)、低通量和高精度需求領(lǐng)域還有少許應(yīng)用。雖然羅氏454在二代測(cè)序儀名落孫山，但是并未放棄，其在臨床檢測(cè)領(lǐng)域也做出了許多的努力。

華大測(cè)序儀作為后起新秀，在不斷布局，覆蓋各種通量和測(cè)序領(lǐng)域，由于其成本相對(duì)較低，并且具有本土優(yōu)勢(shì)，市場(chǎng)較為看好。如果能夠在敏感性與特異性之間做到平衡優(yōu)化就更好了。

Thermo Fisher旗下的多種測(cè)序儀雖然市場(chǎng)占有相對(duì)較小，但是其主要服務(wù)的臨床檢測(cè)行業(yè)的市場(chǎng)前景還是非常向好的。如果能解決Ion Torrent平臺(tái)的傳感器在測(cè)量同一堿基連續(xù)出現(xiàn)時(shí)所產(chǎn)生的誤差也勢(shì)必會(huì)吸引更多的客戶。

總體而言，目前市場(chǎng)的占有還是Illumina公司，其測(cè)序平臺(tái)之間具有高度互補(bǔ)性與交叉性，使得其在短讀長(zhǎng)測(cè)序上大占優(yōu)勢(shì)，但是在讀取那些高AT或高GC富集的片段的時(shí)候錯(cuò)誤率差強(qiáng)人意。并且隨著臨床診斷的興起，Illumina也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

六、測(cè)序儀選擇

以上，小翊給大家介紹了二代測(cè)序儀的基本情況，那怎么樣才能選擇一款合適的測(cè)序儀呢？其實(shí)二代測(cè)序儀選擇主要基于儀器性能指標(biāo)和臨床需要。總體來(lái)說(shuō)，臨床實(shí)驗(yàn)室需要多種用途、性能穩(wěn)定、性價(jià)比高和具有便于操作者試用的生物信息學(xué)工具的測(cè)序儀?？梢跃C合考慮以下幾個(gè)方面進(jìn)行選擇：

參考文獻(xiàn)：李金明，高通量測(cè)序技術(shù)，2018，科學(xué)出版社。