干貨┃TaqMan qPCR實驗您至少需要了解這些！

提到實時熒光定量PCR（簡稱qPCR），想必大家都很熟悉，它是指在PCR反應體系中加入熒光化學物質(zhì)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行定量分析的方法。根據(jù)所用熒光化學物質(zhì)的不同，qPCR可分為熒光染料法（SYBR Green Ⅰ法為代表）和熒光探針法（TaqMan法為代表）。

SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用簡便，價格便宜等優(yōu)點而被廣泛使用。但其大的缺點是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結(jié)合。因此，qPCR反應中有非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)會增加熒光值，影響定量結(jié)果的準確性，而TaqMan探針法的出現(xiàn)解決了染料法非特異性的問題。下面，我們一起來了解一下TaqMan 探針法qPCR。

TaqMan 探針法qPCR原理

TaqMan探針法qPCR是使用TaqMan熒光探針進行熒光檢測的方法。那什么是TaqMan熒光探針呢？它是一段序列特異的、熒光標記的寡核苷酸，其5’端標記一個報告熒光基團（Reporter，R），一般為FAM、VIC、HEX、TET等熒光基團，3’端標記一個淬滅熒光基團（Quencher，Q），一般為TAMRA、MGB等。

圖：TaqMan 探針圖示。R為報告熒光基團，Q為淬滅熒光基團，中間連接的表示核苷酸。

TaqMan探針法qPCR的原理是在PCR擴增時加入一對引物的同時另外加入一條特異性的TaqMan熒光探針，該探針與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。

當探針完整時，報告熒光基團和淬滅熒光基團的空間距離很近，報告熒光基團發(fā)射的熒光信號會被淬滅熒光基團吸收，使儀器檢測不到熒光信號。

在PCR延伸階段，Taq DNA 聚合酶沿著模板鏈從5’到3’的方向合成新鏈，當Taq DNA 聚合酶到達探針結(jié)合位點時，Taq DNA 聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針5’端連接的報告熒光基團切割下來，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測PCR反應體系中的熒光強度可以達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。

圖：TaqMan探針法qPCR原理圖。

TaqMan 探針法qPCR優(yōu)點與應用

1、特異性高、定量準確

從原理可以看出，熒光探針只與目的序列結(jié)合，理論上探針法的熒光信號只來源于目的序列，即不受非特異性產(chǎn)物的影響，因此，TaqMan探針法qPCR的特異性非常高，定量準確。

2、實驗耗時短

因TaqMan探針法的高特異性，故無需再設置熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的特異性如何，大大縮短了實驗時間。

3、兼容多重反應

不同波長的熒光報告基團可以標記不同的探針，因此可以在同一個反應體系中利用不同熒光標記的探針同時檢測多個靶標，達到節(jié)省實驗成本的目的。

正是由于上述優(yōu)點，TaqMan探針法qPCR已被廣泛應用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)的基因檢測，包括疾病的早期診斷、藥物研究、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測等。

圖：TaqMan探針法qPCR的應用

TaqMan 探針法qPCR局限與注意事項

雖然TaqMan探針法有眾多優(yōu)點，但也有明顯的局限性，如探針合成費用較貴，實驗成本較高，探針設計難度大等。因此，在進行實驗前應注意以下事項：

1、設計引物：引物的GC含量建議在40-60%，Tm值在55-60℃。

2、設計探針：

1）探針位置應盡可能的靠近上游引物。

2）探針長度通常在25-35bp，以保證結(jié)合的特異性。

3）探針的Tm值在65-70℃，通常比引物的Tm值高5–10℃，以確保探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，GC含量在40-60%。

4）探針5'端不應含G，因為5’G能夠淬滅熒光信號，以避免報告基團的熒光在探針切割后發(fā)生淬滅。

5）報告熒光基團及淬滅熒光基團選擇：

①選擇報告熒光基團時首先要確認激發(fā)波長和發(fā)射波長與儀器是匹配的。對于多重熒光反應，標記不同探針的報告基團染料的大發(fā)射波長應該至少有15 nm的差異。

②對于淬滅熒光基團，必須要保證其吸收光譜與報告基團的發(fā)射光譜有重合。

常用的報告熒光基團及淬滅熒光基團組合見下表：

表：TaqMan報告熒光基團及淬滅熒光基團常用組合

6）為確保引物探針的特異性，將設計好的序列在blast中核實一次，若發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。

3、確認反應性能：建議用標準曲線確認反應的擴增效率，根據(jù)*的MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)指南，擴增效率需要達到90%-110%，線性相關性R²> 0.98。由于探針是TaqMan實驗昂貴的成分，建議先訂購引物，用SYBR Green I反應來確定引物的性能之后再訂購TaqMan探針。

到這里，本期關于TaqMan qPCR的內(nèi)容就介紹完了，如果您還有其他問題，歡迎下方留言！下面墻裂推薦一波Hieff qPCR系列產(chǎn)品，無論您是用SYBR Green I 染料法還是 TaqMan探針法，總有一款適合您哦~！

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部分高分發(fā)表文獻

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