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得不到陽性克??？可能是忽視了這些細(xì)節(jié)……
過去，提起“分子克隆"或“載體構(gòu)建"這兩個(gè)詞，大家可能想到的是傳統(tǒng)“酶切酶連法"，即用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過堿基互補(bǔ)配對，連接兩個(gè)片段的克隆方法。
近年來，“同源重組技術(shù)"逐漸受到科研人員的歡迎，如翊圣Hieff Clone®一步法快速克隆技術(shù)。相比之下，同源重組技術(shù)操作更加簡單，不受到酶切位點(diǎn)的限制，可一次進(jìn)行多個(gè)片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
雖然同源重組技術(shù)操作簡單，但畢竟實(shí)驗(yàn)過程是環(huán)環(huán)相扣的，一旦某個(gè)細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。為此，小編精心整理了同源重組實(shí)驗(yàn)的常見問題，并給出了可能的原因和解決方案。希望新手們在遇到類似問題時(shí)可快速判斷可能的原因，節(jié)省時(shí)間，更順利的完成實(shí)驗(yàn)。
常見問題分類：
無克隆。
假陽性。
菌落PCR無條帶。
酶切鑒定多條帶。
無克隆
出現(xiàn)無克隆的現(xiàn)象，可能的原因主要是連接不成功或連接成功，但轉(zhuǎn)化失敗。具體原因分別如下：
1、 連接不成功。
可能原因 | 解決方法 |
1）引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤。 | 1）設(shè)計(jì)原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除)+基因特異性引物。 2）判斷方法：可用翊圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件核對，鏈接：h、t、t、p :122.112.245.84:8080/hieff-clone/ |
2）載體與目的片段使用比例失調(diào)。 | 1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。 2）載體與目的片段添加比例： ①單片段建議：適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。 ②多片段建議：適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。 |
3）載體與目的片段不純。 | 1）推薦對線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。 2）純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。 3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應(yīng)體系體積1/5。 |
4）操作問題或試劑盒失效。 | 建議做試劑盒附帶的陽性對照實(shí)驗(yàn)。判斷方法： 1）若陽性對照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。 2）若陽性對照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定問題。 |
2、 連接成功，但無克隆。
可能原因 | 解決方法 |
1）感受態(tài)細(xì)胞效率低，＜107 cfu/μg。 | 建議用轉(zhuǎn)化效率大于107 cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。 判斷方法：可轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），觀察克隆數(shù)，若生長大于1000個(gè)菌斑，則轉(zhuǎn)化效率大于107 cfu/μg。 |
2）抗生素種類錯(cuò)誤。 | 建議將未線性化載體轉(zhuǎn)化涂板。 判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯(cuò)誤或濃度過高。需檢查質(zhì)粒圖譜確認(rèn)抗性或確認(rèn)適濃度。 |
假陽性
出現(xiàn)假陽性的情況，主要表現(xiàn)有兩種，克隆不含插入片段或含有錯(cuò)誤的插入片段。具體原因分別如下：
1、克隆不含插入片段（空載）。
可能原因 | 解決方法 |
1）載體線性化不*。 | 建議將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板。 判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不*。建議優(yōu)化酶切體系。 |
2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒。 | 1）產(chǎn)生原因： ①以反向PCR方式進(jìn)行載體線性化，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板導(dǎo)致。 ②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒，殘留環(huán)狀 質(zhì)粒模板導(dǎo)致。 2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊?。建議PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI 消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。 |
2、克隆含有錯(cuò)誤的插入片段。
可能原因 | 解決方法 |
1）PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。 | 1）可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系，提高特異性； ②膠回收PCR產(chǎn)物； ③鑒定更多的克隆。 |
2）片段缺失。 | 1）可能情況：載體或片段有多個(gè)同源重復(fù)序列。 2）解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對（如NCBI， Vector NTI等）。 |
菌落PCR無條帶
出現(xiàn)菌落PCR無條帶的現(xiàn)象，可能與PCR擴(kuò)增或重組連接有關(guān)，具體原因分別如下：
可能原因 | 解決方法 |
1）菌落PCR引物錯(cuò)誤。 | 建議用載體的通用引物進(jìn)行菌檢，或至少使用一條通用引物。 |
2）PCR體系或程序不合適。 | 1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴(kuò)增都無產(chǎn)物。 2）解決方案： ①優(yōu)化PCR體系、程序； ②提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證； ③換酶切法鑒定克隆。 |
3）連接失敗。 | 1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物，另一端目的引物擴(kuò)增無條帶，但載體通用引物擴(kuò)增有條帶，且大小符合空載。 2）可能原因：載體線性化不*。建議優(yōu)化酶切體系。 |
酶切鑒定多條帶
可能原因 | 解決方法 |
重組載體上有多個(gè)相同的酶切位點(diǎn)。 | 1）換其他酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定； 2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定。 |
以上同源重組的常見問題您中槍過嗎？若有，快來“對號入座“吧。如果還有其它更多關(guān)于一步法快速克隆的問題，歡迎留言或來電。
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