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Qubit核酸濃度檢測，小翊送你資料匯總
（包含實驗常見問題解析）
背景簡介：
目前，實驗室大多采用分光光度計來對DNA和RNA進行定量。雖然這種方法被廣泛采用，但并不意味著它的讀數(shù)是準確而可靠的。因為紫外吸光度測量不具有選擇性，無法區(qū)分DNA、RNA或蛋白質(zhì)，同時一些游離核苷酸或多余的鹽離子也會影響檢測的數(shù)值。此外，紫外分光光度計的靈敏度不足，無法完成低濃度DNA和RNA的定量。
基于此，Life Technologies（賽默飛世爾旗下）推出了Qubit，我們一起來探索一下qubit的神奇之處。
Qubit熒光計
Qubit熒光計是新一代核酸和蛋白定量儀，是Thermo研發(fā)生產(chǎn)的一種檢測核酸質(zhì)量和數(shù)量，并對RNA、ssDNA、dsDNA、蛋白質(zhì)等進行定量的小型儀器，主要用于需要進行高靈敏性、高特異性及高度測量的實驗應用。 目前主要是以qubit3.0和qubit4.0為主。
儀器原理
采用熒光染料檢測特定目標分子的濃度，配套只有與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光的特異性熒光染料。這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時才能發(fā)出熒光信號，采用專門的熒光檢測技術，檢測特定目標分子的濃度，從而對DNA和RNA進行定量。
實驗操作
簡單兩步
1. 配置標準品并測量，儀器自動校正并生成標準曲線；
2. 配置檢測樣本，上機檢測
圖2. Qubit實驗操作流程圖
特點
Qubit技術只檢測靶分子（而不是污染物）的濃度，比如：Qubit檢測雙鏈DNA濃度時，特異性檢測待測樣本中的的雙鏈DNA，對于樣本中存在的單鏈DNA或者RNA不檢測。
這種特異性可以獲得十分的結(jié)果，對于芯片分析（Microarray）和實時定量PCR（qPCR）而言，測定樣本中的DNA或RNA是必需的。同時在新一代測序（NGS）實驗中，對我們后續(xù)的建庫過程也是很必要的。
常見問題匯總
1.Qubit檢測能否指示核酸樣品中的樣品質(zhì)量？
不能，Qubit 檢測僅 樣品中DNA/RNA的量。 Qubit熒光計不能獲取吸光度讀數(shù)以提供A260 / A280比率或檢測核酸樣品中的蛋白質(zhì)。質(zhì)量情況可以使用NanoDrop儀器完成。
2. 產(chǎn)品成分只有兩個標準品，制作標準曲線的時候需要對standard 2進行稀釋嗎？
使用產(chǎn)品時可直接用兩個標準品測定熒光值后做標準曲線，即兩點連成直線。
如果想稀釋多個梯度制作標準曲線，也可以使用1×TE對standard 2 進行梯度稀釋。
另如果擔心96孔板測試時候熒光相互干擾，可選擇黑色的底部透明板。
3.使用酶標儀做Qubit檢測，Ex值480 nm，Em值520 nm，但是我用的儀器沒有這兩個波長設置，其他的波長測定可以嗎？準確度和靈敏度與酶標儀相比如何？
可以，picogreen的吸收峰如下圖，可知Ex在480nm處有大吸收峰，Em在520nm處有大吸收峰，而如果儀器波長不在這兩個上面，也是可以測定的，只不過熒光值會低一點的。
Qubit定量分析的準確度和靈敏度與酶標儀的準確度和靈敏度相同。 這是產(chǎn)品開發(fā)過程中的一項要求。
4. 為什么要做復孔？
Qubit是一個靈敏度比較高的濃度測定儀器，測量值與樣本的質(zhì)量和外界的溫度都有關系，增加復孔可以有效降低測量過程中帶來的誤差，保證數(shù)據(jù)的可準確性。
5. 復孔對應的數(shù)據(jù)不一致？
1）操作誤差；2）樣本質(zhì)量差，濃度低對應的誤差較大；3）片段長度不均一（Qubit里面的染料對于不同長度的DNA結(jié)合能力有差別，重復對應的時間不同，熒光值不同）
6. 環(huán)境溫度不同，測試的值會不同嗎？
會的，Qubit里面對應的熒光染料在不同的溫度下對應的熒光信號強弱會有偏差的，一般在低溫測出的值會偏大大，高溫測出的值偏?。ㄔ谠噭┖兄袠藴势坊謴褪覝販y試時，整體誤差范圍在10%左右，極限誤差在15%左右）
7.測試復孔的時候，連續(xù)測，不取出來，為什么值越來越??？
連續(xù)在激發(fā)光激發(fā)的情況下，熒光染料的半衰期會降低，此時對應收集的熒光信號會降低，對應的數(shù)據(jù)會偏低，建議讀取完數(shù)據(jù)之后，從儀器中取出，5min左右再去測量，基本不會有什么偏差
8. 如何檢測Qubit試劑的測試準確性？
1）相對準確，參考life對應試劑測量，對比結(jié)果分析；
2）準確，試劑盒中配套的標準品，經(jīng)過適當稀釋之后，上機測試，對比結(jié)果分析
對應產(chǎn)品
dsDNA HS Assay Kit for Qubit®
——5min準確定量結(jié)果
dsDNA Assay Kit for Qubit®是Yeasen生物開發(fā)的專門用于Qubit®熒光儀或熒光酶標儀的試劑盒，線性范圍0.2-100 ng，即使在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測dsDNA，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì)、鹽類、洗滌劑等污染物。
簡便：無實驗操作簡單，5min之內(nèi)出結(jié)果；
靈敏： 0.2-100ng的樣本，都能準確定量；
準確：競品同比誤差小，均控制在10%以內(nèi)批間差異小；
穩(wěn)定：不同生產(chǎn)批次之間無差異。
訂購信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
dsDNA HS Assay Kit for Qubit® | 12640ES60/76 | 100/500 T | 686/2696 |
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