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NGS在腫瘤檢測中的那些事兒
一、背景介紹
20世紀以來，癌癥已成為困擾人類健康的主要危害之一。根據(jù)2019年國家癌癥中心發(fā)布的2015年全國//////新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2015年惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，死亡約233.8萬人。平均每天超1萬人被確診為癌癥，每分鐘7.5個人確診癌癥。癌癥負擔呈持續(xù)上升態(tài)勢，近10多年來，惡性腫瘤發(fā)病率每年保持約3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。因而腫瘤基因突變檢測對指導腫瘤靶向治療、耐藥監(jiān)測及預后判斷有重要意義。
圖1：中國2015年惡性腫瘤發(fā)病與死亡人數(shù)圖
二、腫瘤突變類型
腫瘤突變主要來源于體細胞突變和胚系突變。
胚系突變(germline mutation)又稱生殖細胞突變，是來源于精子或者卵子這些生殖細胞的突變，因此身上所有的細胞都帶有突變，目前主要是BRCA1/2，一般研究較少。
體細胞突變(somatic mutation)又稱獲得性突變，是指在生長發(fā)育過程中或者環(huán)境因素影響下后天獲得的突變，通常身上只有部分細胞帶有突變。
圖2：基因突變類型解析圖
體細胞突變包括序列變異、結構變異、腫瘤突變負荷（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）。其中序列變異包括SNV(Single Nucleotide Variation)和Indel（Insertion & deletion）。結構變異包含Deletion、Duplication、Inversion和Translocation。
圖3：序列變異和結構變異解析圖
名詞解釋：
TMB就是基因中發(fā)生錯誤的密碼總量。TMB越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多，每個腫瘤的個性就越突出，越不同于正常細胞。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和殺傷。而腫瘤突變負荷越大（TMB越高），突變越多的癌細胞，越不像正常細胞，越容易被免疫細胞發(fā)現(xiàn)，自然無法逃脫免疫系統(tǒng)的追殺。一般認為TMB超過20個突變/Mb（Mb代表的就是每百萬個堿基）就是高，低于10個突變/Mb就是低。當然，不同的公司，由于所采用的基因套餐以及技術不同，略有差異。
MSI指的是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，指的是在DNA復制過程中段片段插入或者缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，通常由錯配修復MMR功能缺陷引起。以二核苷酸重復序列（CA/GT）n///為常見，n一般是15-60次。MSI在維持基因組穩(wěn)定以及調控基因表達中發(fā)揮重要作用，且個體差異較大。
三、常見的腫瘤突變檢測技術
傳統(tǒng)的腫瘤檢測方法包括Sanger測序、焦磷酸測序和實時熒光PCR等，僅能對單個基因或者單個基因的外顯子突變進行檢測，對復雜變異類型的檢測存在局限性。高通量測序（Nextgeneration sequencing,NGS）能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA///片段進行測序，因此可以在較低的成本下對多至上百個腫瘤相關基因、全外顯子及全基因組進行檢測。
方法 | 優(yōu)點 | 局限 |
Sanger測序 | 讀長較長，準確性高 | 通量小、成本高、需要樣品量大 |
焦磷酸測序 | 讀長較長，平均可達400bp。 | 成本高，在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤 |
實時熒光PCR | 靈敏度與特異性高，準確性較好，實現(xiàn)快速鑒定。適合于大量樣本、少量位點 | 價格貴，不能讀出序列，不太直觀 |
NGS | 不依賴于已知的核酸序列，不需額外設計探針，需要樣品量少，靈敏度高 | 讀長短（200-500bp），可重復性低，拼接組裝的難點 |
四、應用NGS進行腫瘤檢測的技術路線
NGS進行腫瘤基因突變檢測的技術路線主要包括：全基因組測序（WGS）、全外顯子測序（WES）和靶向捕獲測序（targeted sequencing）。
圖4：腫瘤檢測技術路線圖
全基因組測序：
全基因組測序可對整個基因組區(qū)域進行測序，包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)等所有的基因區(qū)域進行測序?？蓪崿F(xiàn)對人類基因組范圍內所有的變異類型進行分析，包括SNV、 Indel,、CNV和 SV，甚至可以進行染色體水平變異的分析。弊端是測序需要很大的數(shù)據(jù)量，成本高，而且其中以大部分數(shù)據(jù)目前尚不能解釋，因此離實際臨床應用還存在較大距離。
全外顯子測序：
全外顯子測序可對基因組上所有的基因外顯子區(qū)域進行測序。全外顯子覆蓋人類基因組1-2%的蛋白質編碼序列。相比于WGS減少了對非編碼區(qū)的測序，成本更低，并且可以獲得更高的測序深度和檢測分辨率。但WES對于臨床檢測來說，腫瘤基因檢測測序深度較高，所需的數(shù)據(jù)量相對較高，因此從臨床應用以及成本考慮，WES并未被廣泛接受。
靶向捕獲測序：
靶向測序是指選擇基因組上感興趣的基因或基因區(qū)域作為靶向檢測區(qū)域，可以是幾個基因上的個別外顯子區(qū)域，也可以是幾百上千個基因上的全部外顯子區(qū)域。靶向測序兼顧了實際檢測需求，又降低了測序成本，因此目前在臨床上的應用///為廣泛。常見方法主要有：探針雜交捕獲以及多重PCR擴增。
五、小結
腫瘤問題屬于世界性難題，一直威脅著人類的健康，是人類生命健康的死敵。近幾年隨著精準醫(yī)療的快速發(fā)展，生命醫(yī)療與生物科學的準確對接，NGS已經(jīng)逐步滲透到腫瘤病理分子診斷領域，大大豐富了腫瘤基因診斷的內容。NGS是目前常用的有效獲取人類癌癥基因組信息的高通量測序方法，能夠勾畫出腫瘤相關的遺傳變異全景，NGS技術為腫瘤精準醫(yī)療的進一步發(fā)展提供了基礎。
六、高效建庫，成就腫瘤突變精準
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® （點這里）
產(chǎn)品特點：
1）建庫流程更簡便：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時間；
2）酶切可控時間長：酶切效果僅與時間有關，與物種來源以及樣本GC含量無關；
3）接頭連接更高效：接頭雙端連接效率高于60%，業(yè)內領///先；
4）文庫擴增更均一：高深度測序條件下，均一性與KAPA HiFi Ready-mix高度一致；
5）突變檢出更高效：突變檢出頻率與標準品預期突變更接近。
性能展示：結果表明翊圣建庫試劑盒突變檢出更高效。
【注】：實驗樣本：Horizon@HD701: Quantitative Multiplex Reference Standard gDNA
七、產(chǎn)品信息
產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
全能型建庫 | Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12200ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI® | 13310ES16/96/98 | 16/96/192 T | |
酶切法建庫 | Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12203ES8/24/96 | 8/24/96 T |
Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI | 13321ES16/96 | 16/96 T | |
環(huán)化試劑盒 | Hieff NGS® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI® | 13341ES16/96 | 16/96 T |
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