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【干貨】小磁珠，大用途，分選純化，一個(gè)不落
引文：
基因測(cè)序越來(lái)越得到臨床的認(rèn)可，尤其是精準(zhǔn)醫(yī)療概念提出以后，更是備受青睞，為精準(zhǔn)治療解答很多未知的問題。高通量測(cè)序技術(shù)的跨越式發(fā)展，使測(cè)序能力大幅上升，整個(gè)NGS工作流程中，測(cè)序文庫(kù)的純化與篩選亦尤為重要。今天，我們就聊一聊核酸純化分選小能手——磁珠。
一、背景介紹
磁珠的發(fā)明構(gòu)想初來(lái)自于挪威科技大學(xué)的化學(xué)家John Ugelstad ，1976年他以聚苯乙烯為主要材料，制造出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報(bào)道在高濃度dian化鈉存在下玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA///片段，而后基于硅膠和其他具有親水性表面的載體的固相核酸純化技術(shù)廣泛發(fā)展起來(lái)。
二、原理解讀
在整個(gè)體系中，影響DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和濃度、孵育時(shí)間等，其中PEG是影響DNA回收的決定性因素。DNA在較高濃度的PEG和NaCl中脫去分子水化層，分子構(gòu)象由線狀被壓縮成卷曲球狀，并暴露出大量帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)與羧基在Na+的作用下形成“電橋"，使DNA被特異吸附到磁珠表面。當(dāng)PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子，會(huì)快速充分水化DNA，解除三者間的離子作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來(lái)。 此外，不同長(zhǎng)度的DNA隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，可以被選擇性的沉淀出來(lái)。
圖 磁珠純化原理示意圖
三、應(yīng)用
磁珠憑借其高通量，適用于自動(dòng)化的特點(diǎn)在高通量測(cè)序中備受推崇，并廣泛用于NGS建庫(kù)中的產(chǎn)物純化/分選。
1. DNA純化
DNA純化的目的在于去除不想要的DNA///片段。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清中的非目標(biāo)片段，之后將磁珠吸附的目的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。此外還有一些客戶會(huì)用于樣本的富集。
圖DNA純化操作示意圖
DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會(huì)有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評(píng)估磁珠的回收能力。通?？赏ㄟ^計(jì)算得出：回收效率=（純化后的DNA質(zhì)量/Input DNA質(zhì)量）×100%，如下表：
表 磁珠回收效率計(jì)算
測(cè)試人 | 樣本編號(hào) | 投入量（ng） | 純化后總量（ng） | 回收率（%） | 平均回收效率（%） |
測(cè)試人1 （1.8×） | A | 169.5 | 153.25 | 90.41 | 90.41 |
B | 159.75 | 94.25 | 94.5 | ||
C | 162 | 95.58 | |||
D | 158.75 | 93.66 | |||
測(cè)試人2 （1.8×） | A | 169.5 | 154.5 | 91.15 | 91.15 |
B | 155 | 91.45 | 91.94 | ||
C | 154.25 | 91 | |||
D | 158.25 | 93.36 |
【注】：磁珠測(cè)試數(shù)據(jù)來(lái)源于上海某生物公司, 表格中A是B*磁珠，B、C、D分別是翊圣三個(gè)不同批次的磁珠。
2. DNA雙輪分選（片篩）
由于二代測(cè)序段短讀長(zhǎng)的局限性，所以終的NGS文庫(kù)需滿足一定的長(zhǎng)度要求。片篩的目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA///片段，以滿足上機(jī)需求。比如將樣本中的片段分布比作下圖中的正態(tài)分布，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，所以第—輪磁珠吸附目的片段以上的大片段，此時(shí)棄磁珠留上清（目的片段在上清中）。第二輪磁珠吸附目的片段，此時(shí)棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。
圖DNA雙輪分選操作示意圖
分選精度則是評(píng)估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測(cè)。
在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果應(yīng)該是頂部窄而圓潤(rùn)的獨(dú)峰。此外不同廠家由于buffer的不同在特定磁珠比例條件下分布也會(huì)有一定的差異，使用前需根據(jù)各廠家相應(yīng)的說(shuō)明書確認(rèn)目標(biāo)片段的分選比例。
圖 不同樣本磁珠分選精度示意圖
四、明星產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® DNA Selection Beads（點(diǎn)這里）
產(chǎn)品特點(diǎn)：
*：采用進(jìn)口原材料，品質(zhì)高度穩(wěn)定。
無(wú)縫替換：產(chǎn)品原理、產(chǎn)品操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果與AMPure XP保持高度一致。
兼容性高：兼容目前市面上所有的DNA/RNA建庫(kù)試劑盒。
批次穩(wěn)定：嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控，單次產(chǎn)能20L。
性能展示1：分選效果與XP高度一致：如下圖所示，相同的分選比例，翊圣磁珠與XP磁珠，分選效果相當(dāng)。
圖 磁珠分選精度與XP對(duì)比示意圖
性能展示2：回收效果與XP高度一致：如下表所示，分別用0.8x和0.6x的回收比例對(duì)DNA marker和打斷的gDNA進(jìn)行回收，翊圣3個(gè)批次的磁珠和XP磁珠回收效果相當(dāng)。
【注】：磁珠測(cè)試數(shù)據(jù)來(lái)源于杭州某生物公司, 表格中分別是B*磁珠與翊圣三個(gè)不同批次的磁珠。
磁珠介紹到這里就結(jié)束了，希望以上總結(jié)可以幫助到正在努力實(shí)驗(yàn)的你。
