活體成像應(yīng)用

                                      ——實(shí)用生物發(fā)光技術(shù)

背景介紹

活體成像指在活體狀態(tài)下在細(xì)胞核分子水平上應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)生物過程和時(shí)間上的定性和定量分析的一門科學(xué)，技術(shù)主要包括生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）、同位素成像(Isotopes)、X光成像(X-ray)等。其中，生物發(fā)光是用熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)表達(dá)的熒光蛋白（GFP、EGFP、RFP、YFP）、熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記，然后利用儀器進(jìn)行檢測。同位素成像是利用放射性同位素作為示蹤劑，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記, 并進(jìn)行活體成像的一種微量分析方法，通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程，其中以生物發(fā)光應(yīng)用較為實(shí)用。

圖1：腫瘤藥物注射后生物發(fā)光、熒光與X光疊加圖（圖源自 slidesplayer）

表：不同成像技術(shù)的比較

活體成像應(yīng)用范圍

生物發(fā)光技術(shù)原理

活體生物發(fā)光技術(shù)是指在動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因（如熒光素酶基因）表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與底物熒光素在氧、Mg²⁺存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能釋放，在體外利用敏感的CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)?？梢员徊迦攵喾N基因的啟動(dòng)子，成為某種基因的報(bào)告基因，通過檢測報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測。

                                         圖2：生物發(fā)光活體成像檢測原理

生物熒光其本質(zhì)為化學(xué)熒光，熒光素被熒光素酶氧化的過程中可以釋放波長廣泛的可見光光子，其波長范圍為460-630nm（平均波長為560nm）。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收藍(lán)綠光波段中的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對(duì)波長為590-800nm的紅光近紅外線吸收能力較差，因此波長超過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織而被高靈敏CCD檢測到。

圖3：CCD檢測儀器及生物發(fā)光成像檢測結(jié)果（左圖源自生物谷）

生物發(fā)光成像應(yīng)用

1.疾病研究

腫瘤學(xué)

熒光素酶基因插入到腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)的隨機(jī)位點(diǎn)，再將該腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)可以建立各種腫瘤模型，用于實(shí)時(shí)觀察體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、轉(zhuǎn)移情況，夠讓研究人員在近無創(chuàng)條件下直接快速觀察研究。其特點(diǎn)是*的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個(gè)細(xì)胞）也可以被檢測的到，比傳統(tǒng)方法的檢測靈敏度大大提高，避免tu殺老鼠而造成的組間差異，節(jié)省動(dòng)物成本。

2.藥物研究

（1）抗腫瘤藥物研究

通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量、不同給藥時(shí)間、不同給藥途徑，觀察并制定合適的劑型與服藥時(shí)間。用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞， 建立各種可視腫瘤模型，實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)各種治療手段的治療效果，可以動(dòng)態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞治療后的變化、腫瘤細(xì)胞是否死亡、腫瘤體積是否變小，這是生物發(fā)光活體成像技術(shù)的重要的應(yīng)用領(lǐng)域。

（2）藥物代謝相關(guān)研究

標(biāo)記與藥物代謝有關(guān)的基因，研究不同藥物對(duì)該基因表達(dá)的影響，從而間接獲知相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。在藥劑學(xué)研究方面，可通過把熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒直接裝在載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律。在藥理學(xué)方面，可用熒光素酶基因標(biāo)記目的基因，觀察藥物作用的通路。

3.細(xì)胞標(biāo)記

免疫細(xì)胞研究：標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺死功能，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移等功能。

干細(xì)胞研究：標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物水平，標(biāo)記干細(xì)胞，若將干細(xì)胞移植到另外動(dòng)物體內(nèi)，可用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷移的過程。

細(xì)胞凋亡:用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制發(fā)光的蛋白（如激素酶），但在其連接處加上caspase，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，表達(dá)caspase，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光素酶開始發(fā)光，觀察細(xì)胞凋亡情況。

4.基因表達(dá)與基因功能的研究

將熒光素酶基因插入到目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。該方式可實(shí)現(xiàn)目的基因與熒光素酶的表達(dá)平行，從而可直接觀察目的基因的表達(dá)模式，包括數(shù)量、時(shí)間、部位及影響其表達(dá)和功能的因素。

5.蛋白質(zhì)相互作用

將分開時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會(huì)被連接到一起，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實(shí)驗(yàn)中無法模擬的活體環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響。

6.其他

生物發(fā)光的其他應(yīng)用如RNAi、蛋白質(zhì)核運(yùn)輸?shù)?。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白的基因，當(dāng)核外的蛋白運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致熒光素酶N端、C端靠近，恢復(fù)發(fā)光。

生物成像的影響因素

一、CCD的性能

二、實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞和基因的表達(dá)情況

三、熒光標(biāo)記物的選擇

四、熒光素酶成像時(shí)，底物濃度和溫度的影響

五、自發(fā)熒光的干擾 

技術(shù)應(yīng)用前景

活體成像技術(shù)能夠?qū)⒎肿由飳W(xué)技術(shù)從體外研究轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)研究。因此，該技術(shù)能夠觀測活體動(dòng)物內(nèi)的基因表達(dá)和細(xì)胞活動(dòng)，并且該技術(shù)具有檢測靈敏度高，操作簡單等優(yōu)勢(shì)，正在越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究領(lǐng)域。可以概括為三點(diǎn)：第—，活體成像技術(shù)可將基因表達(dá)、生物信號(hào)傳遞等復(fù)雜的過程變成直觀的圖像，使人們能更好地在分子細(xì)胞水平上了解疾病的發(fā)生機(jī)制及特征；第二，能夠發(fā)現(xiàn)疾病早期的分子細(xì)胞變異及病理改變過程；后，可在活體上連續(xù)觀察藥物或基因治療的機(jī)理和效果。活體成像技術(shù)作為一種在體探測方法，其優(yōu)勢(shì)在于可以連續(xù)、快速、遠(yuǎn)距離、無損傷地獲得人體分子細(xì)胞的三維圖像。它可以揭示病變的早期分子生物學(xué)特征，推動(dòng)了疾病的早期診斷和治療，也為臨床診斷引入了新的概念。

FAQ

Q1：熒光素鉀鹽、鈉鹽、自由酸區(qū)別？

A：螢火蟲熒光素酶的底物有三種，熒光素自由酸及熒光素的鹽形式，包括鉀鹽和鈉鹽。三者的區(qū)別主要在于：

溶解性：鹽形式易溶于水，鉀鹽溶解度為60mg/ml，鈉鹽溶解度為100mg/ml。自由酸不易溶于水，可用碳酸氫鈉溶液弱堿調(diào)和

毒性方面：鹽形式在使用過程中較方便，尤其是在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，因其能夠溶解在水中，反應(yīng)毒性也會(huì)更小些。

使用效果：無明顯差異。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，選用鉀鹽使用率較高。

Q2：如何能檢測到體內(nèi)發(fā)出的可見光？

A：兩個(gè)主要的原因能夠保證可見光成像技術(shù)能夠檢測到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。a：高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達(dá)到零下-105℃，體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能檢測得到。b：密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括射線在內(nèi)的所有光線。

Q3：CCD鏡頭的低溫會(huì)不會(huì)對(duì)小動(dòng)物產(chǎn)生影響？

A：不會(huì)的，低溫的范圍只局限于CCD鏡頭的小范圍內(nèi)，其他范圍內(nèi)都是室溫。

Q4：用熒光素進(jìn)行活體成像與綠色熒光蛋白檢測體內(nèi)發(fā)光相比優(yōu)勢(shì)何在？

A：熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近100倍。熒光素是靠和熒光素酶的相互作用發(fā)光，特異性很強(qiáng)，得到的信噪比較高；熒光蛋白需要激發(fā)光來產(chǎn)生反射光，但是在檢測的過程中，老鼠的皮毛，皮膚都會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，使得信噪比降低。熒光蛋白檢測更適合于體外檢測，熒光素酶的檢測更適合于體內(nèi)檢測。

Q5：與傳統(tǒng)技術(shù)相比，生物發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在哪些方面？

A：與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該技術(shù)對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究、基因治療、流行病學(xué)的發(fā)病學(xué)研究，干細(xì)胞示蹤，白血病的相關(guān)研究等方面，用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型，來快速直觀的進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究。

Q6：如何用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞嗎？

A：可標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，從該小鼠的骨髓取出造血干細(xì)胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。

產(chǎn)品信息

                                                                                                        HB20191126