“開弓沒有回頭箭”，核酸質(zhì)量是分子實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)

核酸提取是實(shí)驗(yàn)室蕞常見實(shí)驗(yàn)，我們經(jīng)常會(huì)抽提基因組或者總RNA，少則幾份，多則上百份。準(zhǔn)備提取材料，加入TRIzol或裂解液，加入氯////仿、異丙醇，純化柱或手提進(jìn)行核酸沉淀和洗滌、洗脫，半小時(shí)后就可以得到核酸樣本。因?yàn)樘崛?shí)驗(yàn)太平常，以至于我們從來沒有思考過這個(gè)實(shí)驗(yàn)背后的問題。大家通常測(cè)濃度、測(cè)比值，而教科書中已明確告知我們測(cè)出來數(shù)值（純粹核酸的比值范圍是固定的）代表了核酸品質(zhì)，但偏離標(biāo)準(zhǔn)范圍的數(shù)值往往被忽視，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響往往得不到很好的解釋，實(shí)驗(yàn)室為之付出的代價(jià)，要比想象中大的多！

Part I：看了這些案例，我決定評(píng)估模板質(zhì)量了！

核酸多發(fā)揮模板屬性，被用于倍數(shù)擴(kuò)增調(diào)取或富集目標(biāo)序列。以熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)來看，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)是一個(gè)多步驟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，核酸提取無論在所花時(shí)間占比或?qū)嶒?yàn)精細(xì)化程度（如所需設(shè)備及試劑）上，似乎都不夠看的。然而凡是多步驟的實(shí)驗(yàn)，每一步都很關(guān)鍵，如精密化的芯片制造一樣，工序一千起步，這就導(dǎo)致，哪怕每一部合格率都有99%，蕞終良率都會(huì)在0.9×0.9的多次累積下，趨近于0。這也是荷蘭ASML的EVU芯片光刻機(jī)價(jià)值不菲的原因。那對(duì)于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，各環(huán)節(jié)細(xì)微的問題會(huì)被指數(shù)擴(kuò)增予以放大，引起定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。我們來看下，小翊收集到的核酸質(zhì)量對(duì)于結(jié)果影響的案例。

案例1. 降解的RNA，使定量結(jié)果不可重復(fù)！

小翊檢索到一篇關(guān)于RNA質(zhì)量度對(duì)于定量結(jié)果的影響評(píng)價(jià)的一篇文章。文章作者制備了降解程度不同的RNA模板，模板質(zhì)量的評(píng)價(jià)采用的是當(dāng)前蕞*Aligent 2100儀器，將RNA的質(zhì)量劃分為1-10個(gè)等級(jí)，用RIN值（RNA Integrity Number，即RNA完整度）表示，RIN值越接近于10，質(zhì)量越佳。之后，進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)模板質(zhì)量對(duì)于高、低豐度不同的幾個(gè)代表性基因的影響。研究表明：降解的RNA，樣本間重復(fù)性波動(dòng)極/////大，越來越偏離真實(shí)的定量結(jié)果！

案例2. 低純度的RNA，使定量數(shù)據(jù)不可用！

小翊處理過這樣的案子：熒光定量PCR擴(kuò)增曲線平臺(tái)期呈不規(guī)則的鋸齒波浪線（見下圖）。這類結(jié)果嚴(yán)重偏離了規(guī)則的“S”型擴(kuò)增曲線，平臺(tái)期不平穩(wěn)，但能拿到Ct值。通過排除一系列因素，察覺到是RNA加入量過高，但RNA純度不夠，導(dǎo)致抑制劑含量增加，平臺(tái)期出現(xiàn)信號(hào)不穩(wěn)，出現(xiàn)波動(dòng)！由于存在抑制劑，這類數(shù)據(jù)干擾了擴(kuò)增效率，使定量數(shù)據(jù)不可用！ 

案例3. 低純度的基因組，抑制擴(kuò)增！

也有人反饋?zhàn)约旱腜CR結(jié)果不理想，換酶換程序換引物都不能解決問題，卻*忽略了“gDNA質(zhì)量”這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Part II：這些因素干擾核酸評(píng)測(cè)，不可忽視！

看似誰都會(huì)做的核酸提取，其實(shí)是實(shí)驗(yàn)小白的一座不易逾越的大山！較先進(jìn)和科學(xué)的、可對(duì)核酸質(zhì)量評(píng)級(jí)的RIN值、DIN值類的方法更多局限于工業(yè)化實(shí)驗(yàn)室使用，且核酸用途廣泛，核酸質(zhì)量對(duì)每個(gè)分支應(yīng)用的影響也缺乏系統(tǒng)性的解讀。核酸提取實(shí)驗(yàn)成為了重過程、輕結(jié)果的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)屬不得已而為之。較科學(xué)的結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)及核酸質(zhì)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，至今均未系統(tǒng)化的有過普及。下面我們以較為常見的OD值評(píng)測(cè)方法，進(jìn)行介紹，歡迎大家補(bǔ)充。

1. OD比值，該不該重視！

吸光度值測(cè)定方法是通過評(píng)測(cè)不同被檢測(cè)物在特定波長(zhǎng)光譜下的吸光度。不同的純粹物質(zhì)，在不同波長(zhǎng)下具有吸光度。理論上來看，越純粹的物質(zhì)，吸光度值越單一，是有理可循的。因此，可將單一純粹性的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定得到的讀值為標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)測(cè)模板質(zhì)量。

2. 核酸質(zhì)量評(píng)測(cè)的理想OD比值

核酸的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)有共軛雙鍵，在260 nm處有蕞大吸收峰。蛋白質(zhì)和酚類常含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在280 nm處有蕞大吸收峰。碳水化合物、鹽類、有機(jī)溶劑等在230 nm處有蕞大吸收峰。即OD260、OD280、OD230分別代表核酸、蛋白/酚、有機(jī)污染物的吸光度（見下圖）。

以純DNA為樣品，測(cè)定得到的OD260/OD280≈1.8，一般在1.7-1.9之間，OD260/OD230>2.0

OD260/280與洗脫buffer也是有關(guān)系的，若用Elution Buffer（2.5 mmol/L Tris-HCl（pH=8.5））洗脫，較純的DNA其OD260/280在1.7-1.9，若使用TE（pH=8.0）或者水（pH>7.0）洗脫，OD260/280比值也會(huì)偏小，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。

以純RNA為樣品，測(cè)定得到的OD260/OD280≈2.0，一般在1.9-2.1之間，OD260/OD230>2.0

OD260/280比值會(huì)受測(cè)定所用溶液的pH值的影響，例如，溶解RNA在pH=8.5的10 mM Tris緩沖液中OD260/280讀數(shù)在1.9-2.1之間，而在中性的水溶液中比值會(huì)變低，可能只有1.8-2.0。

RNA比DNA紫外吸收高的原因是RNA是單鏈，堿基（共軛雙鍵）得以暴露，紫外吸收峰高，而DNA是雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，堿基互補(bǔ)配對(duì)使得共軛雙鍵隱藏在內(nèi)，堿基堆積力“束縛”對(duì)紫外線的吸收，所以紫外吸收峰較低。所以，純RNA的OD260/OD280比純DNA要大。

3. 偏差標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的OD比值！

針對(duì)DNA樣品而言，

若OD260/OD280＞1.9：表明有RNA污染或部分DNA降解成寡聚核苷酸或單核苷酸（dNTPs），寡聚核苷酸或dNTPs會(huì)提高OD260的值，從而造成OD260/OD280偏高，當(dāng)OD260/OD280>2.2，DNA基本上已*降解。

若OD260/OD280＜1.6：有可能有蛋白質(zhì)殘留，氨基酸殘基中的苯環(huán)在280nm處有吸收從而造成比值偏低，當(dāng)然也有可能是其他苯環(huán)物質(zhì)（酚類）造成的。

若OD260/OD230<2.0：可能是由于乙醇、碳水化合物等在230nm處有吸收，從而導(dǎo)致比值偏低。

針對(duì)RNA樣品，

若OD260/OD280＜1.7：表明在280nm處蛋白質(zhì)或酚類有吸收峰，從而造成值偏低。

若OD260/OD280＞2.0：可能由于RNA的降解，造成260nm處的吸收增強(qiáng)，從而導(dǎo)致比值偏高。

若OD260/OD230＜2.0:  可能是在230nm處，殘留的異硫氰酸胍、β-巰基乙醇、乙醇等有吸收，從而造成比值偏低。

4. 常見污染源的去除方案

模板質(zhì)量評(píng)價(jià)，談何容易！通常，我們還要用通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。

Part III：精心優(yōu)化的核酸提取試劑！

小翊家通過采用*的離心柱及精心優(yōu)化的緩沖體系有效捕獲釋放的核酸，提取的DNA或RNA純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，適用于各種下游應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，如PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)！

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