前言：免疫療法是目前腫瘤治療領(lǐng)域///具前景的發(fā)展方向之一，越來越多的研究靶點(diǎn)進(jìn)入CAR-T療法的臨床實(shí)驗(yàn)。但這類細(xì)胞療法在部分患者中療效短暫、無法應(yīng)對(duì)實(shí)體瘤等問題依然困擾著科學(xué)家們。要實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞更廣泛的治療應(yīng)用，就必須在多個(gè)層面進(jìn)行設(shè)計(jì)和控制，進(jìn)而提高療效和安全性。
 

一、什么是CAR-T療法？
CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell)療法：是指通過基因改造技術(shù)，使患者 T 淋巴細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體，進(jìn)而能特異性識(shí)別、結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原靶點(diǎn)，并同時(shí)激活 T 淋巴細(xì)胞使其大量增殖活化，從而達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，還可形成免疫記憶T細(xì)胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長(zhǎng)效機(jī)制。

CAR-T的結(jié)構(gòu)
CAR的結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)。胞外區(qū)主要是抗原特異性單克隆抗體單鏈可變區(qū)序列，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，二者以鉸鏈連接。其主要作用是以非MHC（Major histocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體）限制性的方式特異性識(shí)別靶細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞表面的抗原，向胞內(nèi)傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)。鉸鏈區(qū)使得嵌合抗原受體更加靈活，促進(jìn)抗原受體與腫瘤抗原的結(jié)合；跨膜區(qū)是CD4、CD8、CD28等跨膜蛋白分子，起到輔助傳遞T細(xì)胞活化信號(hào)的作用；胞內(nèi)信號(hào)肽區(qū)主要是Ｔ細(xì)胞受TCR/CD3ζ 鏈，負(fù)責(zé)向胞內(nèi)傳遞第—活化信號(hào)?；罨?T細(xì)胞大量增殖，并通過分泌顆粒酶、穿孔素、IFN-γ 和 TNF-α等細(xì)胞因子直接殺傷靶點(diǎn)腫瘤細(xì)胞。

（圖源：CAR-T design: Elements and their synergistic function）

二、CAR-T療法的技術(shù)演變
 

第—代CAR
1989年，以色利化學(xué)家和免疫學(xué)家Zelig Eshhar和他的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出了第—個(gè) CAR-T細(xì)胞。第—代的CAR胞內(nèi)只有CD3ζ，在細(xì)胞擴(kuò)增、體內(nèi)存活時(shí)間、以及細(xì)胞因子分泌等方面能力有限，使用率比較低，在腫瘤細(xì)胞的治療中的效果并不好。
 

第二代CAR
2002 年，紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain團(tuán)隊(duì)，在CAR結(jié)構(gòu)中引入了CD28共刺激因子，對(duì)提高初始T細(xì)胞獲得持久的體外增殖和較強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌起到了很好的效果，在臨床試驗(yàn)中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題，并提高了其作用持久性。2004年，共刺激因子4-1BB被發(fā)現(xiàn)也能起到激活T細(xì)胞的作用。第二代CAR在目前的研究中運(yùn)用///廣泛。
 

第三代CAR
2012年，研究者們?cè)贑AR結(jié)構(gòu)中引入2個(gè)共刺激因子，相比于第二代CAR來說，第三代CAR在一些前臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更強(qiáng)更持久的作用活性，但也有報(bào)道指出，三代CAR可能會(huì)造成T細(xì)胞刺激閾值的降低，引起信號(hào)泄露，可能誘發(fā)細(xì)胞因子過量釋放。
 

第四代CAR
四代CAR-T細(xì)胞又被稱為TRUCK T細(xì)胞 ( T-cells redirected for universal cytokine killing )，其在CAR-T細(xì)胞中引入了一個(gè)細(xì)胞因子（主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環(huán)境，募集并活化其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)。

(圖源：AACR)

三、CAＲ-T療法的治療流程
1）細(xì)胞分離：血細(xì)胞分離機(jī)采集腫瘤患者血液中的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）；
2）T細(xì)胞的激活：冷鏈運(yùn)輸?shù)紾MP標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離并激活PBMC中的T細(xì)胞；
3）基因修飾：構(gòu)建攜帶CAR的慢病毒載體，轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增至治療所需劑量；
4）質(zhì)量檢測(cè)：CAR-T細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)合格后，冷鏈運(yùn)輸?shù)结t(yī)院通過靜脈回輸至患者體內(nèi)；
5）監(jiān)控：觀察療效并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)不良反應(yīng)，整個(gè)療程持續(xù)3個(gè)星期左右。

(圖源：AACR)

四、影響CAＲ-T臨床療效的因素
雖然CAR-T療法已取得一定進(jìn)步，但在體內(nèi)增殖、持續(xù)性、腫瘤識(shí)別和殺傷能力、安全性與克服副作用等方面，還需要持續(xù)完善。
 

1、CAＲ的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
共刺激分子胞內(nèi)區(qū)的嵌入的功能區(qū)會(huì)影響CAＲ-T的體內(nèi)活性和持續(xù)性。研究表明在CAＲ結(jié)構(gòu)中嵌入CD28能顯著改善一代CAＲ-T在B細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)的擴(kuò)增和持續(xù)性。目前已有CD28、CD137、CD134、ICOS 和DAP10等多種共刺激
分子的胞內(nèi)區(qū)用于二代CAＲ的研究^[1]。

圖A  T細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)：由異源二聚體形式的抗原特異性α和β鏈組成，α和β鏈與CD3復(fù)合體的ε?δ?γ和ζ鏈緊密相連。T細(xì)胞受體與HLA結(jié)合。
圖B  CAR：包括與腫瘤抗原結(jié)合的單鏈可變片段（scFv）和細(xì)胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域，如CD28和4-1BB以及CD3ζ鏈，它們驅(qū)動(dòng)信號(hào)激活和CAR T細(xì)胞擴(kuò)增。
（圖源：Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.）
 

2、載體系統(tǒng)的選擇
CAR的載體系統(tǒng)可以使用質(zhì)粒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等。應(yīng)用于制備CAR-T細(xì)胞的質(zhì)粒或病毒都必須經(jīng)過鑒別試驗(yàn)、復(fù)制型病毒檢測(cè)、無菌試驗(yàn)、內(nèi)毒素檢測(cè)、支原體檢測(cè)、相關(guān)添加成分的殘留量檢測(cè)、病毒滴度測(cè)定以及效力試驗(yàn)^[2]。
 

不同載體系統(tǒng)的比較^[3]：

五、CAＲ-T療法的優(yōu)勢(shì)和局限性
1、CAＲ-T療法的優(yōu)勢(shì)
1）無MHC限制性
2）可識(shí)別的抗原種類多
3）可以在體內(nèi)繼續(xù)增殖
2、CAR-T療法的局限性
1）毒副作用
2）血液腫瘤可能復(fù)發(fā)，實(shí)體瘤治療效果差
3）制備費(fèi)用高，難以產(chǎn)業(yè)化
 

六、CAR-T療法未來的研究方向
基于CAR-T治療暴露出的局限性，目前有關(guān)CAR-T的研究和開發(fā)，主要圍繞自///殺開關(guān)，消除標(biāo)記，藥理抑制和雙分子CAR設(shè)計(jì)四個(gè)方向來進(jìn)行，旨在降低CAR-T細(xì)胞毒性和提高CAR-T治療的有效性^[4]。

（圖源：Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).）

參考文獻(xiàn)：
[1]Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.
[2]中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)《嵌合抗原受體修飾 T 細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范》
[3]唐曉義, 陳虎, 張斌. 嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞免疫治療的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J]. 解///放///軍醫(yī)藥雜志, 2015, 000(001):12-25.
[4]Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).

 

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