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DNA聚合酶的選擇是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的重要決策之一，相較于準(zhǔn)確度需求較低的菌落PCR等分析實驗，蛋白表達、突變檢測、基因篩選等準(zhǔn)確度要求較高的實驗，則需要選擇高保真DNA聚合酶，以保證擴增過程中的保真度。
什么是DNA聚合酶的保真度
DNA聚合酶的保真度指的是其進行準(zhǔn)確擴增模板的能力，確保DNA序列的高度準(zhǔn)確擴增。高保真酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，可對聚合反應(yīng)時錯配的堿基進行切除，從而保證擴增的準(zhǔn)確性。
錯配率是高保真DNA聚合酶保真性的一個通用標(biāo)準(zhǔn)，錯配率越低保真性越好。保真度常用錯配率的倒數(shù)表示（保真度=1/錯配率）。
圖1. 高保真酶作用原理圖（源于網(wǎng)絡(luò)）
如何測定DNA聚合酶的保真度
常見的DNA聚合酶測定方法有藍白斑篩選測定、一代測序和NGS測序等。
◎ 藍白斑篩選測定
原理：利用DNA聚合酶擴增lacZ基因，基于lacZ基因的α-互補性，它能還原β-半乳糖苷酶基因活性，并產(chǎn)生藍色菌落，結(jié)合藍白斑篩選評估保真度。
操作步驟：用DNA聚合酶擴增lacZ基因，將PCR產(chǎn)物連接到載體上，轉(zhuǎn)化，藍白斑篩選。若lacZ基因存在錯誤，則破壞β-半乳糖苷酶活性，菌落呈現(xiàn)白色，白斑克隆的比例可轉(zhuǎn)化為錯誤摻入的數(shù)量。
操作步驟：根據(jù)DNA模板設(shè)計PCR擴增引物；利用DNA聚合酶進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物克隆至載體上，挑取單菌落進行大規(guī)模Sanger測序，計算發(fā)生錯配的核苷酸數(shù)與聚合的總核苷酸數(shù)的比值（錯配率）。
◎ NGS測序
操作步驟：根據(jù)DNA模板設(shè)計PCR擴增引物；利用DNA聚合酶進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物利用NGS平臺對DNA分子進行雙向測定，篩選正反兩個方向均有效的數(shù)據(jù)，在突變的判定過程中，正反兩個方向均測定出突變的位置記為一次突變，此突變屬于DNA聚合酶引入的突變；如測定只有一個方向測定出現(xiàn)突變，另一個方向測定無突變，則該突變?yōu)闇y序平臺引入的突變，不屬于DNA聚合酶擴增引入的突變，計算DNA聚合酶擴增過程中引入的突變/有效DNA測序量（保真度）[1]。
提示：在PCR擴增中，不同的序列引入突變的概率是有差異的，一般研究人員選擇為多個擴增產(chǎn)物進行測序比較，擴增的目的基因序列在設(shè)置在容易導(dǎo)入基因突變的富含GC 序列區(qū)域以及重復(fù)等區(qū)域。
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高保真酶檢測方法有很多，不同品牌的高保真酶的測定方法不同，一般保真性測定會是相對于Taq DNA聚合酶比較，來判斷DNA聚合酶的保真性。
翌圣生物Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶通過藍白斑篩選測定方法，測定其保真性是Taq酶的52倍，Pfu酶的6倍。
圖2. Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶的保真性是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。
Canace® Gold 高保真DNA聚合酶除了保真性能外，還有延伸速度快、靈敏度高、適用性廣等特點。
延伸速度可達15sec/kb,極速可達1sec/kb
圖3. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶分別擴增小鼠gDNA 2 kb和水稻gDNA 3 kb片段。不同延伸速度（1-60 sec/kb）都可有效擴增。M：1kb DNA Marker。
靈敏度高,可擴增低至1pg模板
圖4. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶擴增質(zhì)粒3 kb片段，不同模板量（1 pg-0.5 μg）都可有效擴增。NC：陰性對照。M：1kb DNA Marker。
適用于不同GC含量片段的擴增
圖5. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶對不同GC含量（30-70%）片段都可高效率的進行擴增。M：1kb DNA Marker。
訂購信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/80 | 100 U/500 U |
2 × Hieff Canace® Gold PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液 | 10149ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
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參考文獻：
[1] 王金. 一種檢測DNA聚合酶保真度的方法:, CN106701896A[P]. 2017.
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