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干貨 | 你對“全能選手”DNase I 了解多少？

2022-4-17　　閱讀(1117)

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干貨 | 你對“全能選手"DNase I 了解多少？


脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I），是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA的非特異性核酸內(nèi)切酶。它能夠水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有5'-磷酸基團(tuán)和3'-OH基團(tuán)的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。DNase I最佳的工作pH范圍是7-8，其活性依賴于Ca2+，并可被二價(jià)金屬離子如Mn2+，Mg2+，Zn2+等激活。在Mg2+存在條件下，DNase I 隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；Mn2+存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。


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圖1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖

常見的DNase I主要從牛胰腺中純化或?yàn)橹亟M酶。與從牛胰腺中純化的DNase I相比，重組酶來源的內(nèi)源性RNase水平相對較低或者能夠制備成無RNase產(chǎn)品形式，更適合對RNase敏感的應(yīng)用，如從RNA樣品中去除DNA。

DNase I 的應(yīng)用


提到應(yīng)用，DNase I除了大家熟知的用于維護(hù)RNA完整性相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如提取不含DNA的RNA，反轉(zhuǎn)錄前制備無gDNA的RNA模板以及體外轉(zhuǎn)錄后降解DNA模板外，還可用于rRNA去除中消化DNA探針，缺口平移進(jìn)行DNA標(biāo)記，足跡法分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用，生成隨機(jī)的DNA文庫，減少細(xì)胞裂解物或蛋白提取物的粘性，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中作為添加物來消化細(xì)胞間的粘連，在細(xì)胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照等。綜上所述，DNase I幾乎可用于任何需要酶切DNA的應(yīng)用中。下面小編簡單介紹幾種常見的應(yīng)用。

“

RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除gDNA


RNA作為實(shí)驗(yàn)室常研究的樣本，其質(zhì)量的高低很大程度上會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。一般在RNA提取過程中無法*避免gDNA殘留，因此，在進(jìn)行具有挑戰(zhàn)性的下游應(yīng)用（例如mRNA表達(dá)量分析，轉(zhuǎn)錄組分析等）之前，通常建議對RNA樣本進(jìn)行DNase I處理，消化殘留的gDNA。消化gDNA步驟可以在RNA提取期間、RNA提取后或者RNA反轉(zhuǎn)錄之前進(jìn)行。

表1：RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除DNA相關(guān)產(chǎn)品列表
定位
產(chǎn)品名稱
翌圣貨號
RNA提取試劑
TRIeasyTM 總RNA提取試劑（同Trizol）
10606ES
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒
19221ES
MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒
19292ES
MolPure® Viral DNA/RNA Kit 病毒DNA/RNA提取試劑盒
19321ES
gDNA去除
Recombinant DNase I (RNase-free)
10325ES
反轉(zhuǎn)錄試劑
Hifair® Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)
11141ES
定量試劑
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix
11184ES

“

體外轉(zhuǎn)錄去除模板DNA


體外轉(zhuǎn)錄（IVT）主要是以DNA為模板，加上對應(yīng)的底物和緩沖液通過體外轉(zhuǎn)錄得到RNA。在體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，常用T7，T3，SP6等RNA聚合酶進(jìn)行RNA合成，合成后的RNA可能會(huì)有DNA殘留，消除DNA殘留有利于下游實(shí)驗(yàn)的開展。如在mRNA疫苗開發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟，可以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。通常使用Recombinant DNase I (RNase-free) 去除模板DNA。
 
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圖2：線性化質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄過程

表2：mRNA合成相關(guān)產(chǎn)品列表
mRNA合成流程
產(chǎn)品名稱
貨號
模板制備
Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶
10148ES
Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒
10922ES
dNTP Mix (25 mM each)
10125ES
FuniCut™系列快速限制性內(nèi)切酶
150開頭
體外轉(zhuǎn)錄
Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit
10623ES
UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade（50 U/μL）
10624ES
T7 RNA polymerase (50 U/μL)
10618ES
NTP Set Solution (ATP, CTP, UTP, GTP, 100 mM each）
10133ES
UCF.ME® Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade
10620ES
UCF.ME® Murine RNase inhibitor GMP-grade
10621ES
去除模板DNA
UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade
10611ES
mRNA修飾
UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade
10614ES
UCF.ME® mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase GMP-grade
10612ES
GTP (100 mM)
10132ES
S-adenosylmethionine (SAM)（32mM）
10619ES
mRNA純化
Hieff NGS® RNA Cleaner
12602ES

“

rRNA去除：常應(yīng)用于RNA建庫測序


在生物體內(nèi)，rRNA豐度高且非常保守，其對于獲取生物信息研究意義不大，所以在RNA建庫測序中常會(huì)先將rRNA去除。目前rRNA的去除方式以RNA酶消法為主，主要操作步驟與原理如下：

操作步驟


1.提取Total RNA；


2.單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結(jié)合（注：需要設(shè)計(jì)與合成rRNA 特異性單鏈 DNA 探針）；


3.RNase H降解雜交的rRNA；


4.DNase I降解DNA 探針；


5.rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。



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圖3：基于酶法的rRNA去除原理示意圖

表3：rRNA去除相關(guān)產(chǎn)品列表
定位
產(chǎn)品名稱
翌圣貨號
人/小鼠/大鼠源rRNA去除
Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(人/小鼠/大鼠)
12253ES
植物源rRNA去除
Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Plant) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(植物)
12254ES
人源rRNA和45S ITS/ETS區(qū)域
Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit （rRNA & ITS/ETS） MaxUp核糖體RNA去除試劑盒（Human rRNA&ITS/ETS）
12257ES
降解rRNA
RNase H
12906ES
降解DNA 探針
Recombinant DNase I (RNase-free)
10325ES

“

缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記


缺口平移法，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種脫氧核糖核酸探針標(biāo)記法。該方法是DNase I與E.coli DNA Polymerase I的聯(lián)合作用實(shí)現(xiàn)的。

主要原理如下：


1.先用適宜濃度的DNase I在待標(biāo)記的雙鏈DNA的每一條鏈上產(chǎn)生若干個(gè)單鏈缺口，缺口處形成3’羥基末端。


2.再用E.coli DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性從缺口處5’端切除一個(gè)核苷酸，同時(shí)E.coli DNA Polymerase I的5’→3’聚合酶活性將一個(gè)帶標(biāo)記的核苷酸引入到缺口的3'端，以修補(bǔ)缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動(dòng)，標(biāo)記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。



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圖4：缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記的原理示意圖

表4：缺口平移法進(jìn)行DNA標(biāo)記相關(guān)產(chǎn)品列表
定位
產(chǎn)品名稱
翌圣貨號
普通級
Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas
10607ES/10608ES
無RNase
Recombinant DNase I (RNase-free)
10325ES
E.coli來源
DNA Polymerase I
12903ES60

“

DNase I 足跡法分析實(shí)驗(yàn)


DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)是一種精確鑒定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點(diǎn)的檢測方法。其原理是蛋白結(jié)合在DNA片段上，能保護(hù)結(jié)合部位不被DNase I破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段（即“足跡")，進(jìn)而可以確定其序列。在凝膠圖片中，相應(yīng)與蛋白結(jié)合的部位沒有條帶。

實(shí)驗(yàn)大致步驟如下：


1.將待檢雙鏈DNA分子進(jìn)行單鏈末端標(biāo)記。


2.將蛋白質(zhì)和DNA混合后，加入適量的DNase I進(jìn)行酶切，形成不同長度的DNA片段。該過程需要控制酶的用量，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個(gè)核苷酸，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對照。


3.從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA用PAGE電泳分離，放射自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。


常見應(yīng)用：轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白通過與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)：凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）。EMSA可以確定蛋白是否與DNA直接結(jié)合，而DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)則可以精確鑒定其結(jié)合的DNA序列。

 
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圖5：DNase I足跡法分析實(shí)驗(yàn)原理圖【1】


翌圣DNase I 選擇指南


產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品定位
推薦應(yīng)用
Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas 脫氧核糖核酸酶I，來源于牛胰腺（CAT#10607，10608）
未對RNase進(jìn)行檢測
主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究: 從蛋白制備物中去除 DNA。
Recombinant DNase I (RNase-free)（CAT#10325）
無RNase殘留，研究級別
適用于各種應(yīng)用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)樣品制備。
UCF.ME® Deoxyribonuclease I  (DNase I) GMP-grade（CAT#10611）
無RNase殘留，GMP藥用級別。采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
適用于各種應(yīng)用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)樣品制備。


參考文獻(xiàn)


[1]Song C, Zhang S, Huang H. Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.



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