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基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)應(yīng)用——血管生成

2022-8-1　　閱讀(883)

血管生成（angiogenesis ）會(huì)與傷口愈合、炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性和腫瘤生長(zhǎng)等存在著密切的關(guān)聯(lián)。在生物體生長(zhǎng)過(guò)程中，血管生成是新組織生長(zhǎng)的重要組成部分。在成年期，除在特殊器官中受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)的周期性事件外，由于促血管生成和抗血管生成內(nèi)源性因素之間的平衡，幾乎每個(gè)正常組織都缺乏大量的生理性血管生成。當(dāng)促血管生成方向的平衡被打亂時(shí)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)檠苌杀硇?，從而開始血管生成反應(yīng)，該反應(yīng)可以被消除或加速。

在研究過(guò)程中所涉及到血管生成實(shí)驗(yàn)，傳統(tǒng)的體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)方法有：角膜微袋、腸系膜、海綿/基質(zhì)植入物、圓盤分析 (DAS)、斑馬魚等。但這些實(shí)驗(yàn)不僅技術(shù)要求高，成本昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)，還會(huì)涉及到道德倫理問(wèn)題等。相較于體內(nèi)做血管生成實(shí)驗(yàn)，在體外利用特殊基質(zhì)維持細(xì)胞生成血管是一種比較經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的實(shí)驗(yàn)[1]，其中的細(xì)胞生長(zhǎng)維持基質(zhì)物就是來(lái)源與EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物——基質(zhì)膠。

基質(zhì)膠主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長(zhǎng)因子。為組織和細(xì)胞提供支撐、抗拉強(qiáng)度和支架支撐，也可以作為細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)的三維亞結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子的儲(chǔ)存庫(kù)，同時(shí)可作為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化的信號(hào)等。翌圣生物開發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質(zhì)膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)保證無(wú)支原體污染，包括基本濃度、高濃度、低生長(zhǎng)因子等不同類型基質(zhì)膠。

應(yīng)用方向

產(chǎn)品特點(diǎn)

安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）

濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/mL之間

批次穩(wěn)定性好：嚴(yán)格生產(chǎn)質(zhì)檢過(guò)程保證批次間性能穩(wěn)定

低內(nèi)毒素：內(nèi)毒素含量≤4 EU/mL

污染物檢測(cè)：經(jīng)檢測(cè)無(wú)支原體和細(xì)菌、真菌殘留

單批產(chǎn)量高：?jiǎn)闻a(chǎn)量在L級(jí)別以上

兼容性好：可與任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基兼容

血管生成實(shí)驗(yàn)

“

實(shí)驗(yàn)步驟

基質(zhì)膠準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前一天，從冷凍冰箱內(nèi)取出CeturegelTM基質(zhì)膠并置于4℃冰箱過(guò)夜融化，同時(shí)對(duì)所使用的耗材預(yù)冷處理。
實(shí)驗(yàn)前將CeturegelTM基質(zhì)膠始終放置在冰盒中。
打開血管生成載玻片滅菌包裝，取出載玻片。
向每孔內(nèi)加入10 μl CeturegelTM基質(zhì)膠，注意加入CeturegelTM基質(zhì)膠時(shí)槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)上孔而留下殘膠。

凝膠

首先蓋上載玻片的蓋子，準(zhǔn)備一個(gè)10 cm的培養(yǎng)皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
將載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
將整個(gè)培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中，靜置30min左右等待膠凝結(jié)，同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

細(xì)胞鋪板

將消化后的細(xì)胞制備成密度為2*10⁵ cells/ml細(xì)胞懸液，充分混勻。
將含有已經(jīng)凝固成膠狀的血管載玻片取出。
每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。
加入細(xì)胞培養(yǎng)基，蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在基質(zhì)膠的表面。

圖像采集

按照細(xì)胞生長(zhǎng)速度定時(shí)觀察拍照、留存圖像。

免疫熒光染色（選做）

小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，切勿碰觸膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋鈣黃綠素使其終濃度為6~8 µg/ml。
加入細(xì)胞染液使其*浸沒細(xì)胞，室溫，避光孵育30~40分鐘。
PBS清洗三次，注意PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。
使用Ex=485 nm，Em=529 nm波長(zhǎng)進(jìn)行熒光觀察

結(jié)果統(tǒng)計(jì)

并對(duì)其成管長(zhǎng)度、覆蓋面積、成環(huán)數(shù)、結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖：血管生成結(jié)果圖

圖：血管免疫熒光染色圖[2]

FAQ

01 拿到的基質(zhì)有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因？

對(duì)于含酚紅的基質(zhì)膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的，但是與5％CO2平衡后色差即會(huì)減少。凍融后，輕輕搖晃試劑瓶使基質(zhì)膠分散均勻。

02 基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項(xiàng)？

所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，應(yīng)使用預(yù)冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀。

03 基質(zhì)膠的如何分裝凍存使用？

可將凍融后的CeturegelTM基質(zhì)膠分裝在多個(gè)小管，所有分裝均需用預(yù)冷的凍存管，迅速冷凍并保存，避免多次凍融。所有涉及到使用的物品在使用前需預(yù)冷，使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管等操作基質(zhì)膠。

[1] Norrby K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep;10(3):588-612. doi: 10.1111/j.1582-4934.2006.tb00423.x.

[2] Benton G, Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Koblinski J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 2014 Dec 15;79-80:3-18. doi: 10.1016/j.addr.2014.06.005.

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品類型	產(chǎn)品名稱	編號(hào)	規(guī)格
基本濃度	Ceturegel^TM Matrix LDEV-Free基質(zhì)膠	40183ES08/10	5/10 mL
基本濃度	Ceturegel^TM Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40184ES08/10	5/10 mL
低生長(zhǎng)因子	Ceturegel^TM Matrix GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40185ES08/10	5/10 mL
低生長(zhǎng)因子	Ceturegel^TM Matrix GFR， Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40186ES08/10	5/10 mL
高濃度	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40187ES08/10	5/10 mL
	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40188ES08/10	5/10 mL
	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40189ES08/10	5/10 mL
干細(xì)胞專用	Ceturegel^TM Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40190ES08/10	5/10 mL
類器官專用	Ceturegel^TM Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40191ES08/10	5/10 mL