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腎臟是人體中重要器官之一，具有清除代謝廢物，維持電解質(zhì)平衡等生理功能，保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腎臟類器官(kidney organoid)是腎臟功能的3D模型，有利于人類腎臟疾病的建模，大多由多能人類干細(xì)胞(PSC)在體外經(jīng)誘導(dǎo)生成，能夠表達(dá)出和人腎單位相似的各類結(jié)構(gòu)，如腎小球足細(xì)胞、近端小管、遠(yuǎn)端小管、集合管等。
我們根據(jù)Nat Protoc.[1]發(fā)表的文章，整理了人類多能干細(xì)胞生成腎臟類器官的培養(yǎng)方案。
圖1.hPSC分化為腎臟類器官的過程(PMID: 28005067)[1]
hPSC接種到包被了無LDEV低生長因子基底膜基質(zhì)的6孔板上，用ReproFF2培養(yǎng)基（含有10 ng/mL FGF2）培養(yǎng)。健康的未分化hPSC顯示出邊界清晰的圓形集落形態(tài)，使用iPS細(xì)胞的解離溶液分離健康的未分化hPSC，每七天傳代。
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，使用Accutase消化細(xì)胞，用ReproFF2培養(yǎng)基(含10 μM Y27632)重懸，接種到包被了無LDEV低生長因子基底膜基質(zhì)的24孔板上，培養(yǎng)3天，更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，3~10 μM CHIR99021，5-25 ng/mL Noggin，100-500 nM Dorsomorphin）繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天換液，直至細(xì)胞形態(tài)為松散形成的密集細(xì)胞團(tuán)（一般需要96 h）。然后更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL activin A）繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。
更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）繼續(xù)培養(yǎng)2天。
圖2.hPSC分化過程中的形態(tài)變化(PMID: 28005067)[1]
Day 0，分化開始時未分化的hPSC (H9)；Day 4，晚期原始條紋階段；Day 9，腎單位祖細(xì)胞期. Day 14，腎囊泡期；Day 21，腎單位期；在第4天進(jìn)行激活素A處理的細(xì)胞的最佳形態(tài)是可見松散密集的簇。
4.1 NPC向腎臟類器官的分化(2D)
步驟3后更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR99021）繼續(xù)培養(yǎng)2天；然后更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）培養(yǎng)2-3天，如果觀察到類似腎小泡的帶有管腔的圓極化結(jié)構(gòu)，則繼續(xù)下一步。如果在3天內(nèi)未觀察到腎泡結(jié)構(gòu)，則通過免疫染色確認(rèn)LHX1是否表達(dá)；然后更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX）培養(yǎng)，每2-3天換液，腎臟類器官在至少長達(dá)3個月的分化中是穩(wěn)定的，腎單位結(jié)構(gòu)可以用顯微鏡識別。
4.2 hPSC向腎臟類器官的分化(3D)
步驟2后使用Accutase消化細(xì)胞，用Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR99021）重懸后接種于超低吸附的圓底96孔板中，培養(yǎng)2天，然后更換為Advanced RPMI 1640培養(yǎng)基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，直到顯微鏡觀察到腎泡狀圓形結(jié)構(gòu)。
圖3.NPC和腎單位的免疫染色(PMID: 28005067)[1]
(a)分化第9天SIX2的免疫熒光顯示NPC。比例尺：50 μm；(b)免疫熒光染色鑒別分化2D培養(yǎng)中第21天的腎單位結(jié)構(gòu)。比例尺：50 μm；(c) 在3D培養(yǎng)中分化的第21天用冷凍切片識別腎單位結(jié)構(gòu)，比例尺：50 μm；(d) 3D培養(yǎng)中第28天（左，比例尺：50 μm）和第21天（右，比例尺100 μm）腎單位的免疫染色，PODXL：一種足細(xì)胞標(biāo)記物，LTL：一種近端小管標(biāo)記物，CDH1：Henle環(huán)和遠(yuǎn)端小管標(biāo)記物；(e)3D培養(yǎng)中第21天類器官的明場圖像，箭頭表示腎小球結(jié)構(gòu)。
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 簡介 |
Y-27632 | 53006ES | 1 mg/5 mg/10 mg | ROCK抑制劑 |
CHIR99021 | 53003ES | 2 mg/5 mg/10 mg | GSK-3α/β抑制劑 |
Dorsomorphin | 53593ES | 5 mg/25 mg | AMPK選擇性抑制劑 |
human Noggin Protein | 92528ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human Activin A | 91702ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF9 | 91305ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF2 | 91330ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
Accutase細(xì)胞消化液 | 40506ES | 100 mL | 細(xì)胞消化液 |
[1] Morizane R, et al. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017 Jan;12(1):195-207.
[2] Little MH, et al. Generating Kidney from Stem Cells. Annu Rev Physiol. 2019 Feb 10;81:335-357.
