越來(lái)越多的神經(jīng)類疾病未被攻克，威脅著人類的健康，所以認(rèn)識(shí)大腦的全部功能并能治療各種神經(jīng)類疾病是每個(gè)神經(jīng)類科研工作者致力的方向。涉及現(xiàn)實(shí)和倫理方面的限制，想要獲取實(shí)驗(yàn)使用的腦組織存在困難，傳統(tǒng)上常使用某些多如嚙齒類動(dòng)物作為模式生物，用于神經(jīng)科學(xué)的研究。但是，人和嚙齒類動(dòng)物的腦組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育相似度并不是很高，因此在體外培養(yǎng)腦類器官是一件非常急需解決的問(wèn)題。

科研人員可以通過(guò)分化人多能干細(xì)胞（hPSCs），包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ips）和胚胎干細(xì)胞（ES），來(lái)獲取神經(jīng)細(xì)胞，在體外模擬人的環(huán)境，培養(yǎng)出腦類器官，有利于研究者發(fā)展治療手段，從而治愈疾病。

研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種將人類多能干細(xì)胞分化為表達(dá)人類中腦特征標(biāo)志物的神經(jīng)元細(xì)胞層的方法，將患者的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，然后置于添加FGF-basic（堿性成纖維細(xì)胞因子）、CHIR-99021，MEK抑制劑（PD0325901）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

DMEM/F12的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基：神經(jīng)基礎(chǔ)、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制劑Y-27632、0.1% β-巰基乙醇、1 μg/mL肝素。前48 h加入Y-27632，第2天改變神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3天后，hMLOs開(kāi)始擠壓神經(jīng)外胚層芽。此時(shí)，培養(yǎng)基被移除，并立即使用配備預(yù)冷200 μL移液管的移液管向每個(gè)孔中加入30 μL還原生長(zhǎng)因子基質(zhì)凝膠。將基質(zhì)嵌入的中腦類器官放入37°C培養(yǎng)箱30 min，使基質(zhì)凝固。

生長(zhǎng)在組織生長(zhǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、0.1% β巰基乙醇、2.5 μg/mL胰島素、200 ng/mL層粘連蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。

分化培養(yǎng)基，包括神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、100 μM抗壞血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β巰基乙醇、10 ng/mL BDNF，10 ng/mL GDNF。培養(yǎng)基中加入了雙抗，以防止長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中潛在的細(xì)菌污染。每3天更換一次培養(yǎng)基。[1]

圖1.人中腦樣類器官每個(gè)階段細(xì)胞的典型形態(tài)（SBNC：SB-431542、CHIR-99021、Noggin）[1]

圖2.神經(jīng)元免疫染色[1]

額顳葉癡呆是一種非常嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，會(huì)導(dǎo)致患者的行為、言語(yǔ)和思考出現(xiàn)問(wèn)題。已知tau蛋白的突變和該疾病息息相關(guān)，但是具體的作用機(jī)制并不十分清楚。因此，研究團(tuán)隊(duì)利用人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）在體外構(gòu)建了額顳葉癡呆的大部分損傷的大腦類器官模型，表達(dá)tau突變蛋白，從而揭示神經(jīng)元損傷的早期的分子水平變化，闡述致病機(jī)理，并發(fā)現(xiàn)一種藥物Apilimod能抑制神經(jīng)元的死亡。

球形形成培養(yǎng)基（SFM）：E8培養(yǎng)基和10 mM ROCK抑制劑Y-27632組成。

分化培養(yǎng)基由E6培養(yǎng)基添加2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；每個(gè)球狀體添加1 mL培養(yǎng)基。將球狀體輕輕混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小時(shí)。

每天從培養(yǎng)皿中輕輕吸出培養(yǎng)基，用分化培養(yǎng)基替換，從第2天到第5天實(shí)現(xiàn)65%培養(yǎng)基交換。第6天，將培養(yǎng)基改為神經(jīng)培養(yǎng)基（NM），包括神經(jīng)基底、B27去除維生素A、谷氨酸和抗A，并添加20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF2。

第25天，每隔一天用NM補(bǔ)充20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3（培養(yǎng)基C），補(bǔ)充65%培養(yǎng)基。從第43天開(kāi)始，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，不添加生長(zhǎng)因子，每個(gè)培養(yǎng)皿更換15-20 mL，75%培養(yǎng)基更換。在整個(gè)培養(yǎng)期間，融合在一起的類器官被一次性手術(shù)刀切割分開(kāi)。在下圖的實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞被生長(zhǎng)和模式化。[2]

圖3.腦類器官中神經(jīng)元存活的縱向軸[2]

圖4. 5 mM谷氨酸處理tau-V337M和等位基因V337V類器官圖像[2]

圖5.5 mM谷氨酸鹽和DMSO處理tau-V337M類器官圖像[2]

 圖6.apilimod可逆轉(zhuǎn)tau-V337M類器官對(duì)谷氨酸興奮毒性的敏感性[2]

人類大腦發(fā)育表現(xiàn)出幾個(gè)的方面，如復(fù)雜性的增加和神經(jīng)元輸出的擴(kuò)大，已被證明很難在模式生物中進(jìn)行研究。因此，體外方法模擬人類大腦發(fā)育和疾病是一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。

在這里，研究團(tuán)隊(duì)建立了類腦器官培養(yǎng)模型，能模仿內(nèi)源性發(fā)育程序，該模型能在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在1~2個(gè)月內(nèi)即可發(fā)育出大腦皮層、腹側(cè)端腦、視網(wǎng)膜等。這個(gè)方案可以應(yīng)用于發(fā)育研究以及各種人類大腦疾病的研究。

此外，由于類器官可以在長(zhǎng)期培養(yǎng)中維持一年以上，它們也有可能模擬后期事件，如神經(jīng)元成熟和存活。

人多能干細(xì)胞產(chǎn)生大腦類器官：添加L-alanyl-L-glutamine solution、ROCK抑制劑Y-27632、N-2 supplement、B27去除維生素A、B27+vitA supplement、Penicillin-Streptomycin、bFGF等。[3]

圖7.人PSCs腦類器官發(fā)育的進(jìn)展[3]

腦類器官培養(yǎng)添加的化合物匯總：

[1] Jo J, et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 2016 Aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27476966; PMCID: PMC5510242.

[2] Bowles K R, et al. ELAVL4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in MAPT mutation cerebral organoids[J]. Cell, 2021(Suppl 5).

[3] Lancaster M A, Knoblich J A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[J]. Nature protocols erecipes for researchers, 2014.