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新品 | HEK293殘留DNA片段分析Kit，輕松實現(xiàn)HCD片段大小質(zhì)控

2023-6-12　　閱讀(265)

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HEK293細胞應(yīng)用及其殘留DNA質(zhì)控
 


HEK293細胞是一種人胚腎細胞系，因其對生長和培養(yǎng)環(huán)境要求不高、易于轉(zhuǎn)染，以及相比于常用的CHO細胞翻譯后修飾（PTM）能力更為強大的特點，目前在工業(yè)內(nèi)也被廣泛用于抗體蛋白生產(chǎn)、疫苗中的病毒樣顆粒生產(chǎn)、細胞和基因治療中的病毒載體生產(chǎn)等領(lǐng)域。但也有實驗證明，HEK293注入裸鼠中可成瘤，所以HEK293宿主細胞殘留成分是生物制品質(zhì)量控制中一個重要環(huán)節(jié)，需要被控制在可接受的水平。

 

嚴格的純化工藝可以去除一部分宿主細胞DNA（HCD）等殘留雜質(zhì)成分，但產(chǎn)品中仍然可能會有HCD殘留，這些殘留的外源宿主細胞DNA會引發(fā)潛在的安全問題（如潛在致瘤性、傳染性，甚至增加免疫源性或?qū)е峦蛔儯?，所以HCD檢測項目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測指標之一。

 

 

殘留DNA風(fēng)險及法規(guī)監(jiān)管要求
 
WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機構(gòu)均對生物制品中外源宿主DNA殘留提出了監(jiān)測和控制要求，以確保生物制品的安全性及質(zhì)量可控性。

 

WHO和美國FDA現(xiàn)行指導(dǎo)方針推薦成品中殘留DNA不高于10 ng/劑，美國FDA還指出生物制品宿主細胞DNA殘留DNA不高于100 pg/劑。歐洲藥典通則規(guī)定生物制品殘留DNA限度大多為不超過10 ng/劑。中國藥典2020年版三部規(guī)定，以細胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100 pg/劑，以細菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗DNA殘留量不能超過10 ng/劑。

 

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp有可能會有一定的致病性，而且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高。DNA片段大小對應(yīng)風(fēng)險等級如下表：

 

DNA片段大小風(fēng)險等級劃分

注：風(fēng)險程度依據(jù)風(fēng)險等級遞增

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

 

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出，需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。
 
 

 

殘留DNA片段分析方法
 
目前，檢測宿主細胞殘留DNA含量的方法都相對成熟，而且藥典法規(guī)也有明確規(guī)定，如《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染料色法和定量PCR法。

 

然而，關(guān)于殘留DNA片段大小的檢測與分析，目前還沒有特定推薦的方法。

 

目前，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數(shù)宿主細胞殘留DNA片段大小為50-2000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產(chǎn)用細胞相關(guān)的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

 

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設(shè)計了四種不同的擴增片段（82bp、133bp、227bp、515bp），用于定量檢測樣本中HEK293宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。樣本類型包括：慢病毒上清液、腺相關(guān)病毒AAV上清液、HEK293細胞裂解液等。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。
 

HEK293殘留DNA片段分析Kit產(chǎn)品性能

符合法規(guī)：按照Chp、USP、ICH等要求進行全面驗證，性能符合中外法規(guī)標準；
保障品質(zhì)：試劑盒原材料全自主研發(fā)，qPCR Mix等酶產(chǎn)品在超潔凈酶工廠生產(chǎn)；
配合審計：保障試劑盒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批間差可控，有完善的審計文件；
靈敏度高：定量限可達10fg/μL水平；
專屬性強：特異性檢測HEK293細胞殘留DNA，不受其他外源基因組DNA干擾；
防干擾強：添加UDG酶，消化常規(guī)產(chǎn)物氣溶膠污染，防止非特異性擴增
 

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品

貨號

品名

規(guī)格

樣本前處理試劑盒

18461ES

MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝）

25T/100T

18462ES

MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒FA（預(yù)封裝）

2×16T/6×16T

核酸提取儀器

80501ES

Auto-Pure 32A automated nucleic acid extraction system Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀

32通量

殘留DNA片段分析試劑盒

41316ES

HEK293 Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit HEK293 宿主細胞殘留 DNA 片段分析試劑盒

4×50T/4×100T

 

參考文獻

[1]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2022年5月。
[2] 閆璐瑤等，宿主細胞殘留DNA片段大小分布檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學(xué)雜志，2021年3月第34卷第3期。
[3] U.S. FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).



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