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Taq DNA聚合酶的非特異擴(kuò)增是PCR實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題，非特異擴(kuò)增直接影響檢測(cè)結(jié)果的判讀并且會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增靈敏度下降，甚至目標(biāo)片段的得率下降等。利用酶修飾劑在常溫下封閉Taq DNA聚合酶酶活中心，抑制常溫下Taq酶的DNA聚合酶活性，是目前抑制非特異性擴(kuò)增的方式。翌圣開發(fā)的雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時(shí)封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號(hào)，雙重提升試劑特異性，使檢測(cè)試劑在運(yùn)輸或室溫使用過(guò)程中都能夠從容應(yīng)對(duì)。
圖1.Yeasen雙封閉熱啟動(dòng)Taq酶抗體產(chǎn)品
注：產(chǎn)品號(hào) - CN202010666417.7
擴(kuò)增特異性——雙封閉抗體可在低溫時(shí)同時(shí)封閉聚合酶和外切酶活性，能有效避免非特異性擴(kuò)增，提高擴(kuò)增特異性
檢測(cè)靈敏度——熱啟動(dòng)形式增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而可保證低豐度基因有效檢出，靈敏度更高
優(yōu)秀產(chǎn)品穩(wěn)定性——37℃放置5天、4℃放置10天性能穩(wěn)定
基線平穩(wěn)線性好——解決了基線上漂問(wèn)題，線性好
酶活釋放速度快——95℃下加熱20 s即可釋放95%以上酶活
酶類適用范圍廣——野生型和突變型Taq酶均適用，每mg抗體可封閉4-10 KU Taq酶（針對(duì)不同類型的Taq酶略有不同）
將合成的引物探針?lè)謩e配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測(cè)兩者熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。
圖2.雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測(cè)
分別用翌圣雙封閉抗體以及T公司抗體對(duì)Taq 酶封閉后通過(guò)ARMS-PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性樣本，發(fā)現(xiàn)翌圣雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴(kuò)增中分型準(zhǔn)確，靈敏度更高。
圖3.ARMS-PCR擴(kuò)增曲線圖
用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴(kuò)增10000拷貝ASF質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線和Ct值無(wú)明顯變化。
圖4.4℃?zhèn)鹘y(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖
圖5.37℃?zhèn)鹘y(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASF質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖
某些引物配合特定buffer和儀器時(shí)，會(huì)出現(xiàn)基線上漂的情況，但雙封閉抗體能解決基線上漂問(wèn)題，更有利于基線平穩(wěn)。
圖6.N基因(A)、ACT基因(B)擴(kuò)增曲線圖
用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴(kuò)增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖7可以看到，兩者線性均良好。
圖7. 雙封閉反應(yīng)液制作ASFV基因、ACT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
分別用進(jìn)口T公司抗體和翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉Taq酶，并在95℃下熱激20 s，檢測(cè)酶活。可以看到95℃熱激20 s后，31303可釋放95%以上的酶活，與T公司抗體相當(dāng)。
表1.95℃下熱激20 s酶活
翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）分別封閉三種類型Taq酶（野生型+2種突變型），封閉比例為1μg : 5U，測(cè)量熒光值以及封閉效率。發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同類型的Taq酶，翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉效果均較好。
表2.不同類型Taq酶的封閉效率
以水為模板作為陰性對(duì)照，小鼠基因組為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增不同批次的31303，觀察條帶，發(fā)現(xiàn)樣品未擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明抗體不存在小鼠基因組殘留。
圖8 小鼠基因組殘留檢測(cè)圖
注：-為陰性對(duì)照，+為陽(yáng)性對(duì)照，1-5為31303不同批次樣品
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
聚合酶與外切酶活性雙封閉抗體 | Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq 酶單克隆抗體 | 31303ES |
聚合酶活性封閉抗體 | Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶單克隆抗體 | 31301ES |
外切酶活性封閉抗體 | Hieff® anti-exonuclease of Taq Antibody Taq酶5'→3'外切酶單克隆抗體 | 31302ES |
