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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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護(hù)航全流程！宿主核酸殘留去除與檢測(cè)完整方案
近年來，生物制品已應(yīng)用到生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)、生物能源、生物制造、生物環(huán)保等多種領(lǐng)域。隨著生物制品的市場(chǎng)占比越來越大，針對(duì)生物制品，國(guó)家和相關(guān)部門也建立起規(guī)范的質(zhì)量管理體系和標(biāo)準(zhǔn)，其中宿主細(xì)胞核酸殘留問題是備受關(guān)注的焦點(diǎn)之一。
生物制品如重組蛋白藥、抗體藥、疫苗、細(xì)胞與基因藥物等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的菌種株/細(xì)胞株表達(dá)的，因而產(chǎn)品內(nèi)可能會(huì)殘存宿主核酸。殘留的宿主細(xì)胞核酸可能引發(fā)細(xì)胞因增殖失控變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，也有可能存在感染性病毒基因從而加劇體內(nèi)免疫反應(yīng)。為了規(guī)避上述不良后果，從生物制品安全角度和科研需求的層面，進(jìn)行有效的核酸殘留去除與嚴(yán)格的殘留檢測(cè)是非常重要的。
我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，在藥典中明確規(guī)定酵母、大腸桿菌表達(dá)的生物制品中的DNA殘留量不超過10ng/劑，CHO和Vero細(xì)胞表達(dá)的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。
在核酸殘留去除工作中，由于DNA帶有大量的電荷與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集（吸附）、包裹作用而難以除去。傳統(tǒng)的方法均存在核酸殘留去除不凈、工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)等缺陷，全能核酸酶則可解決此類難點(diǎn)。
全能核酸酶，又稱非限制性核酸內(nèi)切酶，是一種來源于Serratia Marcescen的非特異性核酸內(nèi)切酶。無論是實(shí)驗(yàn)研究，還是工業(yè)生產(chǎn)，全能核酸酶都是目前能夠同時(shí)有效去除DNA和RNA的酶。翌圣生物UCF.ME®核酸酶在GMP條件下生產(chǎn)，可高效去除各種樣品中的核酸雜質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
翌圣生物UCF.ME®核酸酶可降解無論是單鏈、雙鏈、線性、圓形還是超螺旋形式的DNA及RNA，無堿基偏好性。UCF.ME®核酸酶具有的核酸酶活性以及的耐受性，可適用于多種操作環(huán)境，能夠在非常廣泛的條件下（6 M Urea，0.1 M Guanidine HCl，0.4% Triton X-100，0.1% SDS，1 mM EDTA，1 mM PMSF），短時(shí)間內(nèi)就使樣品中所有的游離核酸降解成長(zhǎng)度為2-5個(gè)堿基的長(zhǎng)度的5'-單磷酸寡核苷酸。后續(xù)也可以通過相應(yīng)的方法去除UCF.ME®核酸酶，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
※可以降解所有形式的DNA和RNA；
※核酸酶活性，樣品中的核酸殘留經(jīng)過短時(shí)間處理就能降低到皮克級(jí)別；
※穩(wěn)定性高，耐受性強(qiáng)，適應(yīng)各種操作條件；
※無動(dòng)物源性、無抗生素；
※GMP條件生產(chǎn)，滿足從研發(fā)到生產(chǎn)的大規(guī)模使用需求；
※審計(jì)資料齊全，產(chǎn)品申報(bào)無憂。
為了測(cè)試產(chǎn)品的使用性能，我們分別測(cè)試了2種溫度條件宿主DNA殘留（GAPDH/Actin）和質(zhì)粒DNA殘留情況（Bla），結(jié)果顯示Yeasen UltraNuclease降解DNA的效率與M公司相當(dāng)。（注：測(cè)試樣本為：HEK293+慢病毒質(zhì)粒）
針對(duì)UltraNuclease，我們還進(jìn)行了使用條件的測(cè)試。測(cè)試結(jié)果如下表。隨著核酸酶使用濃度的升高，所需處理時(shí)間成倍性縮短。針對(duì)Mg2+濃度、pH、溫度、DTT、巰基乙醇、單價(jià)陽離子、磷酸根離子等的最適濃度條件和有效條件我們均作了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏y(cè)試。UltraNuclease的耐受性強(qiáng)。
考慮到不同生產(chǎn)或研究過程中涉及眾多的因素有可能會(huì)影響UltraNuclease的穩(wěn)定性，我們測(cè)定了9大常見因素對(duì)酶活的影響。在實(shí)際的研究中可以根據(jù)自身反應(yīng)工藝結(jié)合我們的測(cè)試數(shù)據(jù)做更加適合的體系優(yōu)化，更大限度的滿足各類特殊需求。
酶類產(chǎn)品通常需要非常嚴(yán)格的運(yùn)輸條件、儲(chǔ)存條件和凍融次數(shù)限制。我們測(cè)試了不同溫度條件下該酶的酶活變化情況、反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)酶活的影響以及干冰運(yùn)輸對(duì)酶活的影響。結(jié)果顯示，-20℃條件下酶活8周均穩(wěn)定；4℃條件下4周內(nèi)酶活僅降低20%；37℃條件下酶活可穩(wěn)定2周。另外再-80至25℃之間凍融10次該酶也表現(xiàn)出較好的酶活特性；冰袋+干冰運(yùn)輸酶活不受影響。
FDA備案
生產(chǎn)流程嚴(yán)格參照ISO9001/GMP的標(biāo)準(zhǔn)，符合GMP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)
符合藥物IND申報(bào)要求
無動(dòng)物源性、無抗生素：使用植物源性和化學(xué)合成原料發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵過程中不添加抗生素
全能核酸酶去除樣本核酸殘留后不免有引入全能核酸酶的影響，針對(duì)上述情況，Yeasen也提供了相應(yīng)的檢測(cè)方案——UCF.ME® UltraNuclease Elisa Kit。該試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)（夾心ELISA）原理檢測(cè)變性與非變性的UCF.ME® Ultra Nuclease全能核酸酶的殘留，用抗UCF.ME®Ultra Nuclease的兔多克隆抗體包被微孔板，形成固相抗體，向固相抗體微孔板中加入U(xiǎn)CF.ME®Ultra Nuclease標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，然后加入生物素（Biotin）標(biāo)記的Anti-Ultra Nuclease多抗，最后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（SA-HRP），形成抗體+ 抗原+抗體-Biotin+SA-HRP復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加入TMB底物顯色；TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)換成黃色，顏色的深淺與樣品中UCF.ME®Ultra Nuclease的量呈正相關(guān)。本試劑盒檢測(cè)定量范圍0.047-3 ng/mL；檢測(cè)下限：23.5 pg/mL。
