熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監(jiān)控的目的，并且可以通過數(shù)據(jù)分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。

熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節(jié)，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結(jié)果，發(fā)表高分文章？

在進行熒光定量實驗時，我們通常會接觸并使用三種圖表，分別是擴增曲線、標準曲線還有熔解曲線。曲線中出現(xiàn)的圖形分別代表著什么？對我們的實驗結(jié)果有什么幫助？類似于熒光閾值、擴增效率、Tm值定義是什么？發(fā)揮著什么樣的作用等等？了解這些元素背后的意義，將有助于我們設(shè)計實驗方案、后續(xù)系統(tǒng)分析實驗結(jié)果~

在熒光定量PCR實驗進程中，熒光定量PCR儀會對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行實時的檢測并記錄熒光信號，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，記錄的熒光信號也不斷的累積。熒光定量PCR擴增曲線便是一條以循環(huán)數(shù)為橫坐標和熒光強度變化為縱坐標的熒光曲線。通常見到的熒光定量PCR擴增曲線會有兩種展現(xiàn)形式，分別是對數(shù)圖譜和線性圖譜，其中會包括基線、熒光閾值、CT值、指數(shù)增長期等。

基線是指初始PCR的最初幾個循環(huán)中(通常為第3 至15個循環(huán))的信號水平，此階段的熒光信號變化極小。低水平的信號相當于PCR反應(yīng)的背景或“噪聲"。該背景信號通常主要來自于反應(yīng)管中的反應(yīng)體系，隨著反應(yīng)的不斷進行，累積的熒光信號會超過背景信號，從而進入下一時期?；€期通常情況下由儀器自動劃定。

隨著PCR“一生二，二生四，四生八"的指數(shù)型擴增，熒光信號也呈現(xiàn)相應(yīng)的指數(shù)型的熒光信號積累。該時期所有反應(yīng)試劑均有盈余，DNA聚合酶仍保持著高水平的活力，擴增產(chǎn)物也相對較少，不會競爭引物的結(jié)合作用。該時期的PCR反應(yīng)具有高度特異性和精確性，只有在這個時期Ct值和初始模板量之間存在線性關(guān)系，故該時期也于定量分析。

理想的PCR反應(yīng)方程：Xn = X0*2n

現(xiàn)實的PCR反應(yīng)方程：Xn = X0* (1+En)n

（備注：n表示擴增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，X0表示初始模板量，Xn表示第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量，En表示擴增效率）

在指數(shù)增長期時，En是一個固定值(理想狀態(tài)下100%)，其中的變量只有初始模板量X0和循環(huán)數(shù)，方便計算。

隨著原料的消耗、產(chǎn)物的積累、酶活的損耗等，DNA的擴增不再呈指數(shù)擴增，熒光信號的增長也逐漸放緩。

由于底物耗盡，酶活性降低等因素，熒光信號不再呈指數(shù)型增加，趨于平穩(wěn)。在實際操作過程中，由于每個反應(yīng)孔中的每個樣品可能具有不同的反應(yīng)動力學，每個反應(yīng)孔進入平臺期的時間點會有所不同，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。

熒光定量PCR儀通常將熒光閾值自動設(shè)置為基線期熒光值標準差的10倍。其存在的目的主要是將相關(guān)擴增信號從背景中區(qū)分出來，從而用于定量計算。熒光閾值遇到特殊情況可以手動調(diào)整，但務(wù)必保證閾值線與擴增曲線的交點位于指數(shù)增長期。

CT值表示每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在擴增曲線圖上顯示為擴增曲線與熒光閾值線交叉點所對應(yīng)的橫坐標。CT值可用于計算起始DNA拷貝數(shù)，研究顯示，CT值與靶標的起始量成反比，起始量約多，CT值約小，反之亦然。靶標起始量之間的差別通?？梢酝ㄟ^CT值粗略估算出來。靶標起始量差了2倍的情況下，CT值的差異通常為1左右(21=2)；靶標起始量差了10倍的情況下，CT值的差異通常為3.33左右(23.33=10)。

通常情況下將已知濃度的樣品(市面上購買的標準品或自己構(gòu)建的質(zhì)粒)經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進行熒光定量PCR，得到一系列的CT值，以已知的稀釋梯度的濃度的對數(shù)作為橫坐標，濃度所對應(yīng)的CT值為縱坐標繪制曲線，即可得到一個標準曲線。通過標準曲線中的一些參數(shù)，可用于判斷相關(guān)實驗樣本同樣靶標的起始量或者評估反應(yīng)效率。

R2值又稱為擬合優(yōu)度，通常用來描述數(shù)據(jù)對模型擬合程度的好壞，表示橫坐標自變量對縱坐標因變量的解釋程度。理論上，R2要等于1，熒光定量實驗中越接近1表示回歸擬合效果越好，一般熒光定量PCR標準曲線至少要求0.98以上。

標準曲線的斜率可用于檢測擴增效率。通常情況下，為了獲得準確且可重現(xiàn)的結(jié)果，反應(yīng)的效率需盡可能接近100%，相當于-3.32的斜率。當反應(yīng)的效率在90%-110%時，相當于-3.58至-3.10的斜率。

正如上方斜率所提到的，擴增效率可用斜率來進行計算。計算方程為：

效率 = 10（–1/斜率） – 1

理論上，在指數(shù)擴增循環(huán)中，PCR產(chǎn)物是2倍增加，反應(yīng)效率為100%，由100%=10（–1/斜率） – 1可推算標準曲線斜率為-3.32，良好的擴增效率需在90%至110%之間，其對應(yīng)的斜率在-3.58至-3.10之間。實際操作時，若擴增效率低于90%，則表明擴增效率偏低，偏低原因可能來自于引物設(shè)計不當，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；若擴增效率高于100%，可能是梯度稀釋樣品加樣錯誤，或者出現(xiàn)類似引物二聚體的的非特異產(chǎn)物擴增。當擴增效率不在90%至110%之間時，建議重新設(shè)計引物或探針。

上圖顯示了不同擴增效率的熒光定量PCR反應(yīng)，該反應(yīng)初始模板量均為1拷貝。數(shù)據(jù)顯示擴增效率差異在PCR反應(yīng)早期不會造成太大的影響。但隨著反應(yīng)的進行，在30個循環(huán)后，100%擴增效率所得到的產(chǎn)物和擴增效率為70%所得到的產(chǎn)物之間存在131倍的數(shù)量差異。因此，在循環(huán)次數(shù)相對較多且需要精確測試的實驗中，保證好的擴增效率尤為重要。

熔解曲線通常出現(xiàn)在染料法熒光定量PCR中，在擴增階段，染料分子會結(jié)合于DNA雙螺旋的小溝區(qū)域，發(fā)出較強的熒光信號。而在熔解曲線階段，隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，結(jié)合染料分子的雙鏈DNA會解離成單鏈DNA，染料分子脫離DNA，熒光信號減弱。當?shù)竭_雙鏈DNA解鏈溫度Tm時(即DNA雙鏈解鏈一半時)，熒光信號急劇下降。以熒光強度和溫度或熒光變化和溫度變化作圖，即可清晰顯示熔解曲線的動態(tài)變化。左圖為熒光和溫度作圖得到的原始熔解曲線，右圖為將溫度與熒光信號的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT)，得到的熔解曲線。通常使用右圖的熔解曲線進行分析更加簡便直接。

熔解曲線分析是一種簡單、直接的分析方法，可用于分析熒光定量PCR反應(yīng)中的引物二聚體、其他非特異性擴增等等，以確保反應(yīng)的特異性。DNA的解鏈溫度Tm受DNA長度、GC含量以及是否存在錯配堿基等因素的影響，因此還可以通過熔解曲線區(qū)分不同的PCR產(chǎn)物，不用再花時間和精力進行凝膠電泳分析。

以上是對熒光定量PCR相關(guān)圖表的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，今后在實驗圖表上分析具體實驗情況更有把握啦。關(guān)于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續(xù)在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。