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圖1.破骨細(xì)胞分化過程圖[1]
在破骨細(xì)胞分化成熟的過程中，RANK /RANKL/OPG系統(tǒng)起著分化調(diào)控樞紐的作用，是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵信號(hào)途徑。核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANKL）被認(rèn)為是促進(jìn)破骨細(xì)胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可誘導(dǎo)RANK在破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上表達(dá)，進(jìn)而使表達(dá)RANK的破骨前體細(xì)胞和RANKL結(jié)合并產(chǎn)生效應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。因此在體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中RANKL和M-CSF兩種細(xì)胞因子缺一不可?，F(xiàn)在破骨細(xì)胞主要采用的誘導(dǎo)法是骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法和RAW264.7細(xì)胞系誘導(dǎo)法。
小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)
實(shí)驗(yàn)方案：
取6-17周齡小鼠，使用CO2吸入或頸椎脫臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。
小心地取出股骨和脛骨，并將其放入10厘米的培養(yǎng)皿中。
無菌條件下準(zhǔn)備股骨和脛骨：
盡可能使用鑷子和剪刀去除所有皮膚、肌腱和肌肉。
用手術(shù)刀或剪刀切掉所有骨頭的兩端。
使用5ml注射器和23-G針頭在新鮮培養(yǎng)皿中用10ml破骨細(xì)胞培養(yǎng)基從所有骨頭中沖洗出骨髓。丟棄已沖洗的骨骼。
使用1ml注射器和27-G針頭，通過將細(xì)胞懸浮液吸入注射器和從注射器中抽出，盡可能分離細(xì)胞聚集體。然后，通過70µm細(xì)胞過濾器沖洗細(xì)胞懸液，并將其放入50 ml錐形離心管中。
用2ml培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞過濾器的尼龍網(wǎng)。
獲得的細(xì)胞懸液300×g，4°C下離心7min，棄上清。
用5ml紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞。冰上裂解10min。
離心，棄上清。再用5ml含10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)基重懸，離心，棄上清。
用5ml含M-CSF (25 ng/ml）和10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每只小鼠一孔），置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜（14至18小時(shí)）。
第二天，吸取培養(yǎng)基，收集未粘附的細(xì)胞，注意勿刮擦平板底部。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50ml錐形離心管中。300×g，4℃，離心7min，棄上清。
用5ml含10%FBS的 α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置計(jì)數(shù)活細(xì)胞。
以1×106cells/ml密度接種于培養(yǎng)板上，并加入M-CSF（50ng/ml）和RANKL（25–100 ng/ml）。
3天后更換培養(yǎng)基。第五天左右一般能觀察到多核成熟破骨細(xì)胞。
TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞。
注意：
使用的RANKL和M-CSF濃度可能因小鼠和實(shí)驗(yàn)室條件而異。
從RANKL和M-CSF添加后的第4天起，每天至少觀察一次細(xì)胞，因?yàn)樾∈笃乒羌?xì)胞在分化后非常不穩(wěn)定。破骨細(xì)胞形成初期，細(xì)胞呈紡錘形，成熟后，細(xì)胞變大，多核，呈圓形。與人類破骨細(xì)胞相反，小鼠破骨細(xì)胞在成熟后24小時(shí)內(nèi)死亡。
由巨噬細(xì)胞系RAW264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)方案：
用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基將RAW264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以3×104 cells/孔的密度接種于24孔板中。
細(xì)胞接種12h后，加入RANKL（20-100ng/ml）。
每3天更換培養(yǎng)基，并同時(shí)補(bǔ)加RANKL（20-100ng/ml）。
較為明顯的多核破骨細(xì)胞將在分化培養(yǎng)4天后開始出現(xiàn)，并在第5天至第6天逐漸變得豐富。
進(jìn)行TRAP染色，鑒定破骨細(xì)胞形成情況。
注意：
RAW264.7細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI-1640或DEME培養(yǎng)基中可以增殖并保持其分化為破骨細(xì)胞的能力，而其在含有10%FBS的α-MEM中培養(yǎng)可進(jìn)行破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)。
RAW 264.7細(xì)胞表達(dá)M-CSF及其受體c-fms。因此，僅加入RANKL就足以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，無需額外加入M-CSF。
（*以上方案供參考，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況具體優(yōu)化）
破骨細(xì)胞能否誘導(dǎo)成功影響因素眾多，其中調(diào)節(jié)信號(hào)通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子至關(guān)重要。翌圣生物提供高活性HiActi™細(xì)胞因子RANKL和M-CSF，高純度、高質(zhì)量，助力破骨細(xì)胞培養(yǎng)。
數(shù)據(jù)展示
高純度（>95%）
高活性(Cell based assay）
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Mouse RANKL | 90630ES08 | 5 μg |
Mouse M-CSF | 91114ES10 | 10 μg |
Human RANKL | 90629ES50 | 50 μg |
Human M-CSF | 91103ES10 | 10 μg |
參考文獻(xiàn)
[1]William J. Boyle*, W. Scott Simonet? & David L. Lacey.Osteoclast differentiation and activation.Nature, 423, pages337–342 (2003).
