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復制型病毒/病毒載體回復突變（Replication Competent Virus, RCV），可產(chǎn)生于病毒載體制造過程中的所有步驟當中。并且，RCV感染宿主細胞后能隨宿主細胞在培養(yǎng)液中增殖、擴增對人體健康具有嚴重的隱患，是免疫細胞治療類產(chǎn)品，如CAR-T產(chǎn)品的主要安全性風險之一。近年來，CAR-T細胞制備過程中，伴隨載體的不斷升級優(yōu)化，重組產(chǎn)生的復制型逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒(Replication Competent Retrovirus / Lentivirus, RCR/RCL)逐漸降低，但產(chǎn)生RCR/RCL的風險隱患至今仍不能排除。由2022年5月發(fā)布的《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）》指出RCR/RCL檢測作為安全性檢測在細胞藥物的研發(fā)和生產(chǎn)過程中至關重要，相關產(chǎn)品不得檢出RCR/RCL，可知病毒載體相關產(chǎn)品中，RCR/RCL的檢測至關重要。
慢病毒( lentivirus，LV) 載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒( human immunodeficiency virus，HIV-1) 為基礎發(fā)展起來的基因治療載體，它源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但又有所不同。LV與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比較，具有感染能力強、容納更大目的片段的基因、能感染分裂細胞和非分裂細胞和很少引發(fā)免疫反應等優(yōu)點，目前被選為CAR-T細胞產(chǎn)品的主要病毒載體。
《CAR-T細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》一文提到：目前 RCR/RCL 的檢測方法主要有指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法(p24蛋白測定)、PCR/q-PCR法（通過psi-gag或VSV-G聚合酶鏈反應）和轉(zhuǎn)錄酶活性測定法(PERT)等。其中，利用指示細胞培養(yǎng)法對生產(chǎn)過程中的病毒（上清液、病毒生產(chǎn)終末期細胞）存在的RCL進行培養(yǎng)擴增，并在培養(yǎng)終點進行重復檢測是FDA推薦的RCL檢測方法。
指示細胞培養(yǎng)法分為2個階段，初始擴增階段和指示階段：初始擴增階段是將待測樣品與C8166-45細胞（人類臍帶血淋巴細胞）共培養(yǎng)21天，至少傳代5次后收集細胞上清，分別采用ELISA法測定培養(yǎng)基中的P24蛋白表達量和與新的C8166-45細胞一起共培養(yǎng)，7 d后采用2種不同原理的方法檢測RCL，如ELISA、PCR或qPCR(psi-gag／VSV-G PCR，ELISA p24，PERT)。RCL指示細胞培養(yǎng)法分組和檢測如圖1和2。
圖1.指示細胞共培養(yǎng)分組
圖2.RCL檢測方法
根據(jù)現(xiàn)有法規(guī)和指導原則可以發(fā)現(xiàn)，RCL的檢測方法主要包含指示細胞培養(yǎng)法、ELISA法、PCR/q-PCR法和PERT法。因為指示細胞培養(yǎng)法檢測需28天，并且因為陽性對照病毒的性質(zhì)，要求其需要在P3或者P2實驗室環(huán)境中進行，致使該方法具有耗時長，環(huán)境要求高的特點。相比而言,基于VSV-G序列的q-PCR方法或基于psi-gag序列的PCR方法，因其具有檢測時間短、環(huán)境條件簡單、靈敏度高和可重復性強等優(yōu)點，被許多CAR-T申報企業(yè)作為快速放行方法。
除卻指示細胞培養(yǎng)法，其他3種快速檢測RCL的檢測方法優(yōu)缺點如下：
ELISA 法(p24 蛋白測定)：適用于由載體生產(chǎn)過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。但，對于VSV-G 包膜質(zhì)粒和來源于其他病毒的 gal-pol 基因功能組件之間發(fā)生重組不表達p24蛋白的假型病毒不適用。其優(yōu)點為適用性廣（濃縮載體、終末細胞、血清血漿等多種樣本）、靈敏度高和可定量等。
使用qPCR的方法測定VSV-G基因和PCR方法檢測由病毒載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組產(chǎn)生的psi-gag基因序列，具有靈敏度高，可重復性和操作簡單等優(yōu)點。
測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的方法，它可以用來檢測RCL相關的不同結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)病毒，缺點為在某些細胞檢測中，存在背景高的現(xiàn)象。
美國FDA要求對于采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體的產(chǎn)品，需要在整個生產(chǎn)過程及不同階段進行RCL/RCR檢測，針對載體生產(chǎn)用主細胞庫、工作細胞庫、生產(chǎn)終末細胞、載體上清液及在體外培養(yǎng)超過4天的載體轉(zhuǎn)到細胞進行檢測，具體如如圖3。針對慢病毒載體使用時RCL的檢測，除了金標準——指示細胞培養(yǎng)法，還需要選擇2種不同原理的快檢方法對其進行補充檢測。
圖3.RCL/RCR檢測階段
參考文獻：
1、FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) Guidance for Industry［S］2020．
2、FDA. Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up Guidance for Industry [S]. 2020.
3、Briefing Document — Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products — Revisiting Current FDA Recommendations.
4、Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. [S]. 2020
5、國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 免疫細胞治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）. 2022.
6、《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，國家藥監(jiān)局藥品審評中心，2022.
7、《免疫細胞治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，國家藥監(jiān)局藥品審評中心，2022.
8、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）》,國家藥監(jiān)局藥品審評中心，2022.
9、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則（試行）》,國家藥監(jiān)局藥品審評中心，2022.
10、盧加琪, 李倩與何伍, 《體外基因修飾系統(tǒng)藥學研究與評價技術指導原則(試行)》解讀. 中國新藥雜志, 2023. 32(02): 第118-122頁.
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