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漲知識(shí) | qPCR專場(chǎng)六：一文讀懂qPCR文章金標(biāo)準(zhǔn)-MIQE

2023-9-15　　閱讀(297)

熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種檢測(cè)方法。該方法通過(guò)在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來(lái)記錄DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的，并且可以通過(guò)數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來(lái)源。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔呢？

日常在進(jìn)行qPCR時(shí)，需要注意多個(gè)操作細(xì)節(jié)，有時(shí)稍不留意就會(huì)拿到奇怪的實(shí)驗(yàn)結(jié)果或拿不到數(shù)據(jù)結(jié)果。另外在最后的數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上，不同人對(duì)于數(shù)學(xué)的理解不同，會(huì)導(dǎo)致不同的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)相同的結(jié)果，不同的人對(duì)同份數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出的結(jié)論也不相同。發(fā)表的文章如果缺乏充足的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，將會(huì)妨礙審稿人、編輯等對(duì)于結(jié)果質(zhì)量的評(píng)估，或者讓小伙伴難以根據(jù)文章重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2009年，Stephen A等人發(fā)表文章《The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》，這是一群qPCR大牛經(jīng)過(guò)商討制定的qPCR實(shí)驗(yàn)和發(fā)表文章指南，其目的是為了作者根據(jù)指南提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，審稿人據(jù)此可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所用方法的可靠性，其他研究人員也可以利用這些信息進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

MIQE指南由9個(gè)部分組成，共涉及85個(gè)參數(shù)，以保證qPCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。這9 部分包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)基因、qPCR引物和探針、qPCR實(shí)驗(yàn)報(bào)告、qPCR合理性和數(shù)據(jù)分析。85個(gè)參數(shù)針對(duì)qPCR結(jié)果的重要性，分為了兩類(lèi)：其中標(biāo)記為“E"表示必須(essential)，標(biāo)記為“D"表示建議(desirable)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

科學(xué)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是基因表達(dá)分析研究的關(guān)鍵。由于在整個(gè)研究過(guò)程中，目的RNA的轉(zhuǎn)錄易受到研究過(guò)程中其他無(wú)關(guān)的外部刺激因素干擾，因此嚴(yán)格設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件的工作十分重要。重要內(nèi)容包括了確定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的條件、重復(fù)組的類(lèi)型和數(shù)量(例如生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù))、實(shí)驗(yàn)程序、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行條件以及各組內(nèi)樣品的處理方法等等。

樣本采集與處理

樣本采集可能是實(shí)驗(yàn)變異的第一個(gè)變異來(lái)源，尤其是RNA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)镽NA容易被樣本的采集和處理方式干擾而不穩(wěn)定。建議將新鮮組織保存在低溫環(huán)境中。樣本采集時(shí)應(yīng)相當(dāng)謹(jǐn)慎，應(yīng)詳細(xì)記錄組織樣本的采集以及是否及時(shí)處理等信息。如果樣本沒(méi)有及時(shí)處理，需記錄是如何保存的，以及在什么情況下保存了多長(zhǎng)時(shí)間。

核酸提取與質(zhì)量控制

核酸提取是第二個(gè)關(guān)鍵步驟，尤其是RNA提取，確保使用高純度和未降解的RNA是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的一點(diǎn)。提取效率取決于樣本類(lèi)型、樣本密度、樣本來(lái)源的生理狀態(tài)、樣本處理量等等。這些過(guò)程細(xì)節(jié)對(duì)于組織中提取RNA的數(shù)量和質(zhì)量影響重大，故需記錄核酸提取方法的細(xì)節(jié)。

針對(duì)提取得到的RNA等核酸進(jìn)行量化十分重要，尤其是在比較分析不同樣本時(shí)，RNA等核酸投入一致或類(lèi)似的數(shù)量能夠避免一系列不確定因素。另外RNA等核酸的質(zhì)量評(píng)估也必不。常見(jiàn)的量化和質(zhì)量評(píng)估方法有多種，最為常見(jiàn)的是分光光度法，但需要注意的是A260/A280比值必須在中性PH值buffer中進(jìn)行測(cè)量，吸光度比值會(huì)受到DNA或者殘余苯酚的影響而改變且不能評(píng)估核酸是否發(fā)生降解，故最好搭配其他檢測(cè)方法，例如瓊脂糖凝膠電泳、或者是參考基因/靶基因3‘：5’完整性檢測(cè)。如果RNA樣本部分降解，該信息在發(fā)表文章時(shí)需要告知，因?yàn)榈退睫D(zhuǎn)錄檢測(cè)的敏感性可能降低，其中降解帶來(lái)的差異可能會(huì)造成不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

RNA提取過(guò)程中也應(yīng)包括DNA酶處理步驟，用以去除相關(guān)的基因組DNA污染。建議對(duì)RNA樣本是否經(jīng)過(guò)DNA酶處理(包括DNase類(lèi)型和反應(yīng)條件)等做好記錄。

核酸中雜質(zhì)殘留的檢測(cè)應(yīng)通過(guò)稀釋樣本做反轉(zhuǎn)錄以檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄活性或PCR抑制程度，或者采用SPUD等抑制實(shí)驗(yàn)。

反轉(zhuǎn)錄

由于環(huán)境中普遍存在RNA酶，建議在RNA質(zhì)量評(píng)估后立即將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，從而避免RNA多次反復(fù)凍融造成的降解風(fēng)險(xiǎn)。反轉(zhuǎn)錄時(shí)，建議使用相同數(shù)量的RNA進(jìn)行1次或3次反轉(zhuǎn)，并保證所有實(shí)驗(yàn)的反轉(zhuǎn)錄時(shí)間相同，從而最小化生物重復(fù)之間的變異性。對(duì)于RNA轉(zhuǎn)化成cDNA的方法和試劑描述必不，例如RNA投入量，試劑的詳情，酶投入量，溫度，反應(yīng)時(shí)間和操作步驟等等。

qPCR

qPCR分析時(shí)，須準(zhǔn)備好以下信息：每個(gè)靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的database accession numbers，每個(gè)引物和任何探針的外顯子位點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸的序列和濃度，包括性質(zhì)、位點(diǎn)和結(jié)合任何染料和/或修飾堿基。還需要聚合酶的濃度和特性，每個(gè)反應(yīng)模板的質(zhì)量，鎂離子的濃度，緩沖液的確切化學(xué)成分和反應(yīng)體積。對(duì)應(yīng)使用的儀器型號(hào)、耗材和所有PCR反應(yīng)條件信息也應(yīng)做好記錄。耗材多為塑料制品，不同制造商的塑料在熒光反射和靈敏度方面表現(xiàn)出很大差異。96孔板使用時(shí)，密封方法的不同也會(huì)影響板材周邊樣品的蒸發(fā)。

由于擴(kuò)增效率高度依賴于所用的引物，因此也需要將序列進(jìn)行公開(kāi)。

引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸的結(jié)構(gòu)(例如莖環(huán)二級(jí)RNA結(jié)構(gòu))對(duì)于反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率有著重要的影響。故而引物、探針和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的位點(diǎn)需考慮到RNA的折疊。

引物的特異性

引物的特異性需用直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證有效性，例如凝膠電泳、熔解曲線、DNA測(cè)序、擴(kuò)增子大小、和/或限制性酶切驗(yàn)證。一些引物優(yōu)化的證據(jù)或方案最好也可提供，理想的形式是退火溫度梯度或Mg2+濃度梯度摸索并以Cq值、熒光與循環(huán)曲線圖的形式呈現(xiàn)數(shù)量和/或熔解曲線。

質(zhì)控和定量標(biāo)準(zhǔn)

所有qPCR反應(yīng)都需要進(jìn)行額外的質(zhì)控或定量標(biāo)準(zhǔn)品，例如使用NTC檢測(cè)PCR污染。每96孔板或每批樣品上樣應(yīng)包括NTC，并確定數(shù)據(jù)不符合的條件，舉個(gè)例子，如果未知低濃度的Cq值為35，則可以忽略Cq值≥40的NTC。

性能分析

4.1擴(kuò)增效率

穩(wěn)定和精確的熒光定量PCR檢測(cè)通常和高效的擴(kuò)增效率相關(guān)。尤其當(dāng)檢測(cè)經(jīng)內(nèi)參基因校準(zhǔn)的目的基因mRNA濃度時(shí)，擴(kuò)增效率尤為重要?！鳌鰿q法是測(cè)定樣品間不同基因表達(dá)情況用的方法之一，是基于單個(gè)內(nèi)參基因的校準(zhǔn)進(jìn)行的。計(jì)算靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Cq值的差異，并直接比較不同樣本之間的△Cq，這種情況需要兩個(gè)基因能以可比的效率進(jìn)行擴(kuò)增，方能進(jìn)行比較。

擴(kuò)增效率必須通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定，因?yàn)檫@種校準(zhǔn)方法提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速以及可重復(fù)擴(kuò)增效率、分析敏感性和實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的平均指標(biāo)。擴(kuò)增效率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)數(shù)線性部分的斜率確定。每個(gè)靶標(biāo)基因的的標(biāo)準(zhǔn)曲線需提交在稿件中，這樣審稿人能夠看到。

4.2線性動(dòng)態(tài)范圍

根據(jù)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)至少包括3個(gè)數(shù)量級(jí)，理想狀態(tài)是5或6 Log10濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間需包括被定量的靶標(biāo)基因的區(qū)間。由于定量下限通常定義不明確，應(yīng)當(dāng)確定線性區(qū)間內(nèi)低濃度的變化。同時(shí)需要展示相關(guān)系數(shù)(R2 值)

4.3靈敏度(LOD)

LOD的定義是可以檢測(cè)到95%的陽(yáng)性樣品的低濃度。換言之，在一組含有目的基因的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，在LOD濃度下，不應(yīng)發(fā)生超過(guò)5%的失敗反應(yīng)。實(shí)際上，我們可以通過(guò)有限稀釋法來(lái)檢測(cè)，失敗和成功反應(yīng)的百分比覆蓋泊松分布即可。

4.4精度

熒光定量PCR結(jié)果的變化有多種原因，包括溫度的差異可影響退火或變性，移液誤差引起的濃度差異和隨機(jī)變化。qPCR精度和濃度相關(guān)，一般隨著拷貝數(shù)的降低而降低。理想情況下，實(shí)驗(yàn)內(nèi)的重復(fù)性應(yīng)當(dāng)以SD error bar或具有重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的CIs的形式顯示在圖中。CVs不應(yīng)與Cqs一起使用，但可用于表達(dá)拷貝數(shù)或濃度的差異。

多重?zé)晒舛縋CR

多重實(shí)驗(yàn)大大擴(kuò)展了qPCR分析的能力，特別是應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)點(diǎn)突變或多態(tài)性檢測(cè)。多重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)需要證明多個(gè)靶標(biāo)的準(zhǔn)確量化在同一管中不會(huì)受到干擾，即，擴(kuò)增效率和靈敏度和進(jìn)行單重實(shí)驗(yàn)時(shí)是一致的。這點(diǎn)當(dāng)豐度較低的靶標(biāo)基因和豐度高的靶標(biāo)基因進(jìn)行共同擴(kuò)增時(shí)尤為重要。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析包括對(duì)原始數(shù)據(jù)的檢查、對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和可靠性的評(píng)估，以及生成可報(bào)告的結(jié)果。

均一化

均一化是進(jìn)行科學(xué)qPCR分析的一個(gè)重要組成部分，該過(guò)程控制核酸抽提效率、反轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增效率的變化，從而能夠比較不同樣本的RNA濃度。使用內(nèi)參基因作為內(nèi)部對(duì)照是最常見(jiàn)的均一化RNA數(shù)據(jù)的方法。均一化包括靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的RNA濃度之比。內(nèi)參基因的RNA應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)，其基因豐度與樣品中mRNA總量呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)。

均一化通常不能用一個(gè)內(nèi)參基因，除非作者可為審稿人提供明確的證據(jù)證實(shí)內(nèi)參基因在其實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)恒定。內(nèi)參基因的最佳數(shù)目和選擇需通過(guò)文章具體實(shí)驗(yàn)確定并報(bào)告方法。

變異性

生物體本身固有的變異性可能與組間的實(shí)驗(yàn)差異相匹敵，甚至超過(guò)后者。尤其是使用許多生物學(xué)重復(fù)來(lái)提高實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性時(shí)，這種變化就變得顯而易見(jiàn)。雖然生物重復(fù)間的差異可能很大，但是足夠數(shù)量的樣本可以減少實(shí)驗(yàn)差異性。許多因素會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)變異，從而影響到達(dá)統(tǒng)計(jì)所需的生物重復(fù)的數(shù)量。因此，功效分析(power analysis)有助于確定有效可靠結(jié)論所需的樣本數(shù)。

定性分析

使用PCR僅檢測(cè)核酸是否存在，而不是對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，被稱為定性PCR，該方式廣泛應(yīng)用于病原體診斷。PCR方法定性/定量分層問(wèn)題在于，準(zhǔn)確回答是或否，需要低敏感性PCR實(shí)驗(yàn)的敏感性信息。因此，即使是定性分析也應(yīng)提供有關(guān)分析能力的相關(guān)信息。

術(shù)語(yǔ)統(tǒng)一

實(shí)時(shí)定量PCR的簡(jiǎn)寫(xiě)

建議將縮寫(xiě)qPCR用于real-time PCR，并將RT-qPCR用于反轉(zhuǎn)錄-qPCR。將RT-PCR簡(jiǎn)稱為qPCR會(huì)引起混淆，并且與傳統(tǒng)RT-PCR的應(yīng)用不符。

內(nèi)參基因

內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。

TaqMan探針

TaqMan探針應(yīng)指為水解探針(hydrolysis probes)。

FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機(jī)制，指發(fā)射/猝滅依賴于兩個(gè)熒光染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間相互作用。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。

定量 quantification

牛津英語(yǔ)詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當(dāng)?shù)?，而不是quantitation。

現(xiàn)在文獻(xiàn)中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(diǎn)(crossing point, Cp)和分支點(diǎn)(take-off point, TOP) 與PCR循環(huán)的術(shù)語(yǔ)不一致。這些術(shù)語(yǔ)指的實(shí)際上是相同的值，只是由于不同儀器廠家由于產(chǎn)品差異化的原因造成的，不具有科學(xué)的準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)RDML（Real-Time PCR Data Markup Language）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，建議統(tǒng)一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。

※該指南的目的主要有三個(gè)：

1. 讓作者能夠設(shè)計(jì)和報(bào)告具有更大內(nèi)在價(jià)值的qPCR實(shí)驗(yàn)。

2. 給到審稿人和編輯既定標(biāo)準(zhǔn)用于衡量所收稿件的技術(shù)質(zhì)量。

3.遵守指南中的準(zhǔn)則，人們可以更容易地重復(fù)已發(fā)表研究中所描述的實(shí)驗(yàn)。

以上是對(duì)qPCR金標(biāo)準(zhǔn)指南-MIQE的介紹，相信小伙伴們通過(guò)小翌的介紹，對(duì)MIQE指南已經(jīng)有一定的了解啦。關(guān)于如何做好qPCR實(shí)驗(yàn)，小翌會(huì)陸續(xù)在公眾號(hào)里傳授秘籍噠，敬請(qǐng)期待哦。

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