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漲知識 | 克隆專題一：不同分子克隆方法介紹（上）

2023-10-13　　閱讀(892)

漲知識 | 克隆專題一：不同分子克隆方法介紹（上）

克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯，而英文“clone"則起源于希臘文“Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性"的演講上采用“克?。–lone）"的術(shù)語，把“克隆技術(shù)"帶到了人們的視野中。

克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)"，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆"，又稱重組DNA技術(shù)，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復(fù)制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。

隨著分子生物學研究的不斷深入，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆、Gateway技術(shù)等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學的發(fā)展和進化提供新的力量。今天小翌就帶領(lǐng)大家認識一下不同的分子克隆方法。

傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)

傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的依賴于限制性內(nèi)切酶和酶切位點。主要步驟是通過限制性內(nèi)切酶（翌圣的FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶Cat#15001ES-15051ES）酶切載體和目的基因，通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）將酶切的片段拼接在一起（即連接過程），形成可以表達目的基因的新載體（即重組質(zhì)粒），使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，進而實現(xiàn)目的基因的擴增、轉(zhuǎn)錄和翻譯。

傳統(tǒng)分子克隆實驗流程如下圖：

圖1.傳統(tǒng)分子克隆實驗流程

該技術(shù)最早由Cohen Group在1973年實現(xiàn)，他們將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒體外限制酶切割，連接成新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer，實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)較為成熟，但是該方法受到限制性酶切位點和連接效率等方面的限制，并不能高效、準確的克隆需要的目的基因。

圖2. Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一個成功實現(xiàn)基因工程技術(shù)的團隊）

TA克隆

TA克?。∣riginal TA Cloning Kit），依賴于PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，通常在克隆片段的3’末端加上A尾（即3’-A），通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）把克隆片段與一個具有3’-T突出的載體DNA連接起來。主要應(yīng)用于不清楚目的基因DNA序列的實驗，通過TA克隆重組到T-載體后，使用T-載體的上下游引物擴增片段，測序，最終確定目的基因序列。其中，聚合酶的選擇尤為重要，翌圣普通PCR試劑盒（Cat#10102/10103/10157）、翌圣快速PCR試劑盒（Cat#10157）均具有Taq DNA聚合酶，擴增后的PCR產(chǎn)物具有3’-dA突出端，可輕松克隆至T載體。

圖3. TA克隆流程示意圖【3】

TOPO克隆

TOPO克隆技術(shù)是通過TOPO載體上偶聯(lián)的異構(gòu)酶(Topoisomerase)實現(xiàn)插入片段的快速克隆。其原理是利用Topo載體兩端通過磷酸鍵偶聯(lián)的Topo酶，在連接反應(yīng)中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng)。不同于傳統(tǒng)的TA克隆，TOPO克隆能夠在2-5 min內(nèi)快速完成插入片段和載體的連接反應(yīng)，操作簡單，連接效率。

圖4. TOPO克隆原理

目前市面上的產(chǎn)品，需根據(jù)DNA片段末端的不同，選擇不同的TOPO克隆試劑盒。而翌圣新品零背景通用型TOPO克隆試劑盒（Cat#10906），能夠兼容平末端產(chǎn)物或粘性末端產(chǎn)物，不受片段末端影響，快速克隆連接，效率高，陽性率接近100%，如圖5所示。

圖5. TOPO TA/Blunt克隆試劑盒輕松連接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段
注：A&B：TOPO克隆轉(zhuǎn)化平板。C&D：插入片段PCR鑒定電泳圖。

無縫克隆技術(shù)

傳統(tǒng)克隆和TA克隆兩種方法費時費力，過程繁冗，為了解決限制性酶切位點的限制，科學家們研發(fā)出新的、快速、簡潔、高效的克隆技術(shù)——無縫克隆，區(qū)別于傳統(tǒng)分子克隆，的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上15-20個與載體序列同源性的堿基，依靠堿基間作用力互補配對成環(huán)，不經(jīng)過酶切，PCR產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶的作用下，經(jīng)過一定的時間和溫度即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。

圖6.同源重組原理

無縫克隆技術(shù)最早是2009年由Daniel Gibson和J. Craig Venter發(fā)展起來，廣泛應(yīng)用的方法包括兩種Gibson Assembly和In-Fusion Cloning，原理都是通過外切酶產(chǎn)生黏性末端，再通過同源重組酶的連接得到重組片段，但是兩種方法的外切酶不同，形成重組序列的方式也不一樣。

Gibson Assembly：包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三種酶，通過5’→3’ T5核酸外切酶活性，沿著5’→3’方向降解dsDNA，產(chǎn)生3’黏性末端，通過同源臂互補配對，退火后借助Phusion DNA聚合酶修復(fù)片段上的缺口，Taq DNA連接酶催化片段形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，獲得重組片段。

圖7. Gibson Assembly原理圖【5】

In-Fusion Cloning：具有3’→5’ 核酸外切酶，能夠識別3’末端堿基，沿著3’→5’ 方向降解dsDNA，產(chǎn)生5’黏性末端，同源臂互補，退火后配對，因為其不含連接酶，所以要將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞內(nèi)，序列中的缺口會在感受態(tài)體內(nèi)補平、連接，獲得重組片段。

圖8. In-Fusion Cloning原理【6】

翌圣同源重組試劑盒利用無縫克隆技術(shù)，僅需50℃反應(yīng)20 min即可轉(zhuǎn)化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。其中，翌圣一步法快速克隆試劑盒（Cat#10911ES）可連接單片段，該試劑盒已發(fā)文章累計IF達到1000+。翌圣通用型一步法快速克隆試劑盒（Cat#10922ES）可連接1-6片段，最長連接片段可達23 kb，是多片段連接的。

通過上述的介紹，相信大家已經(jīng)初步了解了目前實驗室中常用的分子克隆技術(shù)，那么還有哪些新開發(fā)的分子克隆技術(shù)呢？無縫克隆中不常見、特殊的分子克隆技術(shù)又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中，給大家介紹新的分子克隆技術(shù)，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~

相關(guān)產(chǎn)品列表

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	規(guī)格
通用緩沖液，5min完成精準酶切	FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶	15001ES-15051ES	50 T
常規(guī)PCR	2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye)	10102ES03/08	1 mL/5×1 mL
常規(guī)PCR，不含染料	2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye)	10103ES03/08	1 mL/5×1 mL
快速PCR，快至1s/kb	2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)	10157ES03/08	1 mL/5×1 mL
TOPO克隆-兼容TA/平末端	Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit	10906ES20	20 T
TOPO克隆-TA末端	Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒	10907ES20	20 T
TOPO克隆-平末端	Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit	10909ES20	20 T
單片段一步克隆，已發(fā)文章累計IF達到1000+	Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒	10911ES20/50	20 T/50 T
1-6片段一步克隆，最快5分鐘完成重組反應(yīng)	Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆試劑盒	10922ES20/50	20 T/50 T

參考文獻

1.Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(1), 189-193.
2.Holton TA, Graham MW. A Simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J]. Nucleic Acids Ｒes, 1991, 19(5), 1156.
3.Clark D P, Pazdernik N J, Mcgehee M R. Cloning Genes for Synthetic Biology - ScienceDirect[J]. Molecular Biology (Third Edition), 2019:199-239.
4.Seki T, Seki M, Onodera Ｒ, et al. Cloning of cDNA encoding a novel mouse DNA topoisomerase III (Topo IIIbeta) possessing negatively supercoiled DNA relaxing activity, whose message is highly expressed in the testis[J]. J Biol Chem, 1998, 273 (44): 28553-28556.
5.Gibson DG, Young L, Chuang ＲY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nat Methods, 2009, 6( 5) : 343-345.
6.張陽璞,楊淑慎.幾種新型植物基因表達載體的構(gòu)建方法[J].生物工程學報,2015,31(03):311-327.

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