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類器官（organoids）是指利用干細胞、祖細胞、腫瘤細胞等在體外培養(yǎng)出的3D細胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結構組織類似物。2021年，類器官技術被列為“十四五"國家重點研發(fā)專項，作為疾病模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，類器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機理等與體內環(huán)境更加接近，在多領域將發(fā)揮重要，諸如細胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領域。
以下內容小翌將通過講述小鼠小腸類器官培養(yǎng)的全過程及相關注意事項為大家在培養(yǎng)過程中減少踩坑概率。
實驗所需材料
應用方向 | 材料名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
腸組織消化 | Cebrary®Tissue Digestion Solution 組織消化液 | 41423 | 30ml |
70um 細胞篩網(wǎng) | 542070 | 70um | |
耗材設備 | 培養(yǎng)皿 | 84003 | 100mm |
離心管 | 83503/83505 | 1.5ml&15ml | |
移液管 | 84503 | 5ml | |
類器官培養(yǎng)支持 | Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠 | 40191 | 5 mL |
培養(yǎng)基成分及添加劑 | DMEM/F12基礎培養(yǎng)基 | 41420 | 500ml |
DPBS | 41403 | 500ml | |
EDTA | 60126 | 100g | |
BSA | 36100 | 25g | |
Recombinant Human RSPO1 Protein | 92278 | 100ug | |
Recombinant Human Noggin Protein, His Tag | 92528 | 100ug | |
Recombinant Human EGF Protein | 92708 | 100ug | |
Recombinant Human Wnt -3a protein | 92276 | 100ug | |
NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸) | 50303 | 1g | |
HEPES | 60117 | 100ml | |
L-alanyl-L-glutamine solution,200mM | 60701 | 100ml | |
B-27 supplement without Vitamin A,serum free,50X | 60704 | 10ml | |
N-2 supplement,serum free,100X | 60706 | 5ml | |
類器官收集 | Cebrary®Cell recovery solution for Organoid類器官回收液 | 41421 | 30mL |
類器官凍存 | Cebrary®Cell freezing medium for Organoid 類器官凍存液 | 41422 | 30mL |
小腸類器官培養(yǎng)步驟
樣本制備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌環(huán)境下截取出近胃端處3~15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。
樣本清洗：使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術剪將腸管小心剪開，腸腔面朝上，手使用手術刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)組織透明），將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗2~3次。
樣本初處理：將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小塊狀體，順勢轉移至新的50ml離心管中，用DPBS輕柔清洗3-5次，除去腸絨毛細胞和漂浮脂肪組織。
樣本消化：在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA的預冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期間每10min輕搖一次離心管。
消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。
在小腸組織碎片中加入10~15ml預冷的含0.1%BSA的DPBS，反復吹打、重懸組織碎片，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當看有大量隱窩樣結構后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液使用70μm濾網(wǎng)過濾并收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液。
重復步驟5-6兩次，1500rpm、4℃離心 3min。
混合物形成：用Ceturegel®基質膠重懸隱窩組織沉淀，每10μL基質膠懸液包含200~600個隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質膠形成凝膠。
注意：基質膠稀釋比例≥50%以保證培養(yǎng)過程中Ceturegel®基質膠結構的穩(wěn)定性。
將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免懸液接觸孔板側壁。
將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質膠凝固。
待Ceturegel®基質膠凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的腸類器官培養(yǎng)基，每孔 800μL/孔。
將 24 孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，一般小鼠小腸類器官在5~7天內形成。
實驗結果
圖.小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)結果圖
小腸類器官的傳代
培養(yǎng)5~7d或小腸類器官中央變黑時可進行傳代，提前將24或12孔板放于培養(yǎng)箱中孵育至少30min。吸走待傳代的培養(yǎng)液，加1mL/孔冷的DPBS，1min后挑起基質膠，用1mL槍頭將基質膠輕輕吹散，用注射器一次性吸走懸液，重復操作1次，將懸液加入5mL離心管中，1200r/min，4℃、5min離心，棄上清，按每孔1∶3傳代。
小腸類器官的凍存
選擇生長狀態(tài)旺盛的類器官(一般傳代后3~4d)，進行凍存，每兩孔凍存一管。吸去培養(yǎng)液，加入1mL細胞凍存培養(yǎng)液，用槍頭將加入類器官回收液的基質膠吹散，后將懸液加到細胞凍存管中，放于凍存盒中，于-80℃冰箱放置1d，后轉入液氮長期保存。
小腸類器官的復蘇
將24孔板放于培養(yǎng)箱預熱30min。取出液氮中的凍存管并置于37℃水浴鍋中，當凍存液溶解時取出，用1mL注射器抽吸一次，然后將細胞懸液轉移到15mL離心管中，1200r/min、4℃，離心5min，棄上清，加入5mL冰DPBS重懸，重復上述離心步驟，棄上清。按照類器官培養(yǎng)的步驟鋪板和培養(yǎng)。
消化組織選擇什么消化液，消化時長是多少？
組織的消化液可以選用EDTA或膠原酶，如果消化空腔性器官EDTA適合，如小腸和胃；膠原酶有不同類型，消化的組織類型比較廣泛，可以搭配DNA酶一起。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)小時。
不同孔板培養(yǎng)類器官培養(yǎng)所需的基質膠和培養(yǎng)基體積?
培養(yǎng)類器官常用的是24孔板培養(yǎng)，按50μl/孔形成膠滴，再加入500μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96孔板按10μl/孔形成膠滴，再加入200μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種植多個50μl膠滴，加入2~3ml培養(yǎng)基覆蓋膠滴。
產(chǎn)品類型 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 |
基本濃度 | Ceturegel® Matrix LDEV-Free基質膠 | 40183ES08/10 | 5/10 mL |
Ceturegel® Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠 | 40184ES08/10 | 5/10 mL | |
低生長因子 | Ceturegel® Matrix GFR，LDEV-Free 基質膠 | 40185ES08/10 | 5/10 mL |
Ceturegel® Matrix GFR， Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠 | 40186ES08/10 | 5/10 mL | |
高濃度 | Ceturegel® Matrix High Concentration，LDEV-Free 基質膠 | 40187ES08/10 | 5/10 mL |
Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠 | 40188ES08/10 | 5/10 mL | |
Ceturegel® Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基質膠 | 40189ES08/10 | 5/10 mL | |
干細胞專用 | Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質膠 | 40190ES08/10 | 5/10 mL |
類器官專用 | Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質膠 | 40191ES08/10 | 5/10 mL |
小腸類器官培養(yǎng)基 | Cebrary® Intestinal Organoid Growth Medium (Mouse) 小鼠腸類器官生長培養(yǎng)基 | 41426ES60/76 | l00/500mL |
