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純干貨！巧用外泌體示蹤，探索細胞通訊奧秘！
外泌體，作為細胞間通訊的重要載體，近年來在臨床醫(yī)學(xué)精準治療領(lǐng)域中引起了廣泛的關(guān)注。外泌體含有豐富的活性物質(zhì)，可以調(diào)控細胞間的信息交流，在藥載遞送、無細胞治療、疾病診斷方面具有潛在的技術(shù)應(yīng)用藍海。
目前可以通過差速離心、過濾、免疫親和、層析、流式細胞分選、密度梯度離心等多種手段大致分離出不同的細胞外囊泡亞群，再利用外泌體示蹤技術(shù)追蹤外泌體在體內(nèi)的分布和歸宿，以及它們與細胞的相互作用，在細胞治療領(lǐng)域中具有重要作用。
親脂性染料可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合，直接使用熒光染料（如PKH26、PKH67、DAPI、DiO等）標記外泌體，通過熒光顯微鏡觀察和分析外泌體，染色效果較好，是目前較為常見的示蹤方法。
圖1.染料標記外泌體染色效果
通過將外泌體表面或內(nèi)部的核酸（如miRNA、siRNA等）標記為熒光探針或放射性標記物，利用核酸雜交或放射性測量等技術(shù)來追蹤外泌體的運輸和內(nèi)部化過程。
利用特定的抗體或標記蛋白（如GFP、Luciferase等）標記外泌體表面的特定蛋白質(zhì)，通過免疫熒光染色或酶活性測量等方法來追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，外泌體的特定蛋白 CD63 和綠色熒光蛋白 GFP 的表達元件構(gòu)建成質(zhì)粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有綠色熒光，如下圖2。
圖2.用 GFP 標記的外泌體分別與 SH-SY5Y、BV2細胞共培養(yǎng)
利用磁性納米顆粒（如超順磁性鐵氧體顆粒）標記外泌體，通過磁共振成像或磁力測量等技術(shù)來追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化過程。
圖3.USPIO標記外泌體的體內(nèi)核磁共振成像
使用放射性同位素（如99mTc、125I等）標記外泌體，通過放射性測量技術(shù)（如放射性計數(shù)或正電子發(fā)射斷層掃描）來追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，研究人員用鋯 89 ( 89 Zr)標記GMP級別外泌體的定量生物分布和藥代動力學(xué)，如圖4。與熒光或生物發(fā)光成像相比，放射性核素成像因其對深部組織成像的出色靈敏度和定量測量的潛力而為生物分子治療的體內(nèi)跟蹤提供了多種優(yōu)勢。
圖4.89Zr標記外泌體不同注射時間在小鼠和大鼠體內(nèi)的定量分布
穩(wěn)定性
選擇具有良好穩(wěn)定性的染料，以確保染料在外泌體內(nèi)的持久性和可靠性；
選擇性
選擇能夠特異性地與外泌體結(jié)合的染料，以避免與其他細胞或細胞組分結(jié)合。
可觀察性
選擇能夠在所使用的觀察技術(shù)中產(chǎn)生強烈信號的染料，以確保外泌體的可視化和檢測。
毒性
選擇對細胞和外泌體沒有或很低毒性的染料，以避免對實驗結(jié)果的干擾。
常用的外泌體染料包括熒光染料（如DiI、DiO、PKH67等）和蛋白質(zhì)標記染料（如CD63、CD81等抗體標記染料）。這些染料可以通過熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)和電子顯微鏡等技術(shù)來觀察和檢測外泌體。PKH可提供長時間的活細胞熒光膜標記，且無明顯毒性作用。膜染料PKH67是一種綠色熒光染料，其激發(fā)（490 nm）和發(fā)射（504 nm）波長與熒光素和FITC相近。PKH26是紅色光譜中的熒光染料，其峰值激發(fā)（551 nm）和發(fā)射（567 nm）波長特性與羅丹明或藻紅蛋白（PE）檢測通道兼容，并且也可以被488 nm激光激發(fā)。目前PKH染料已成功用于體外和體內(nèi)跟蹤實驗中標記外泌體和細胞外囊泡。例如，一項研究發(fā)現(xiàn)，人脂肪組織源間充質(zhì)干細胞（ADSCs）釋放的外泌體可以通過熒光染料PKH26進行標記，并且這些標記的外泌體可以釋放功能性的neprilysin，從而對腫瘤具有治療效果。
總的來說，外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中也有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標志物，可用于監(jiān)測臨床狀態(tài)，治療反應(yīng)，疾病進展等，同時由于它們具有遞送生物分子的功能，因此它們還有發(fā)展成臨床藥物遞送載體的潛力
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hieff® exosome tracker kit (for red fluorescence)外泌體紅色熒光示蹤試劑盒 | 40780ES | 20 µL |
Hieff® exosome tracker kit(for green fluorescence)外泌體綠色熒光示蹤試劑盒 | 40781ES | 20 µl |
Hieff® Quick exosome isolation kit(for Cell Culture Media) 細胞培養(yǎng)上清外泌體快速抽提試劑 | 41201ES | 25 mL/50 mL |
Hieff® Serum-free medium(for exosome) 外泌體專用無血清培養(yǎng)基 | 41210ES | 50 mL/500 mL |
Hieff® Quick exosome isolation kit Plus(for Cell Culture Media) 細胞培養(yǎng)上清外泌體快速提取分離試劑盒 | 41205ES | 10 T/20T |
Hieff® Quick exosome isolation kit Plus(for Serum/Plasma) 血清/血漿外泌體快速提取分離試劑盒Plus | 41206ES | 30 T |
Hieff® Quick exosome isolation kit（for Serum/Plasma）血清/血漿外泌體快速抽提試劑盒 | 41202ES | 30 mL |
Exosome identification kit for Western Blot 外泌體鑒定試劑盒 | 41203ES | 5 T |
文獻參考:
[3]Polanco JC, Li C, Durisic N, Sullivan R, G?tz J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
[4]Ren R, Tan XH, Zhao JH, Zhang QP, Zhang XF, Ma ZJ, Peng YN, Liu QB, Zhang HY, Li YQ, He R, Zhao ZQ, Yi XN. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome uptake and retrograde transport can occur at peripheral nerve endings. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
