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純干貨！巧用外泌體示蹤，探索細(xì)胞通訊奧秘！
外泌體，作為細(xì)胞間通訊的重要載體，近年來(lái)在臨床醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)治療領(lǐng)域中引起了廣泛的關(guān)注。外泌體含有豐富的活性物質(zhì)，可以調(diào)控細(xì)胞間的信息交流，在藥載遞送、無(wú)細(xì)胞治療、疾病診斷方面具有潛在的技術(shù)應(yīng)用藍(lán)海。
目前可以通過(guò)差速離心、過(guò)濾、免疫親和、層析、流式細(xì)胞分選、密度梯度離心等多種手段大致分離出不同的細(xì)胞外囊泡亞群，再利用外泌體示蹤技術(shù)追蹤外泌體在體內(nèi)的分布和歸宿，以及它們與細(xì)胞的相互作用，在細(xì)胞治療領(lǐng)域中具有重要作用。
親脂性染料可以與外泌體的脂質(zhì)雙層膜穩(wěn)定結(jié)合，直接使用熒光染料（如PKH26、PKH67、DAPI、DiO等）標(biāo)記外泌體，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和分析外泌體，染色效果較好，是目前較為常見(jiàn)的示蹤方法。
圖1.染料標(biāo)記外泌體染色效果
通過(guò)將外泌體表面或內(nèi)部的核酸（如miRNA、siRNA等）標(biāo)記為熒光探針或放射性標(biāo)記物，利用核酸雜交或放射性測(cè)量等技術(shù)來(lái)追蹤外泌體的運(yùn)輸和內(nèi)部化過(guò)程。
利用特定的抗體或標(biāo)記蛋白（如GFP、Luciferase等）標(biāo)記外泌體表面的特定蛋白質(zhì)，通過(guò)免疫熒光染色或酶活性測(cè)量等方法來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，外泌體的特定蛋白 CD63 和綠色熒光蛋白 GFP 的表達(dá)元件構(gòu)建成質(zhì)粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細(xì)胞，使細(xì)胞分泌的外泌體帶有綠色熒光，如下圖2。
圖2.用 GFP 標(biāo)記的外泌體分別與 SH-SY5Y、BV2細(xì)胞共培養(yǎng)
利用磁性納米顆粒（如超順磁性鐵氧體顆粒）標(biāo)記外泌體，通過(guò)磁共振成像或磁力測(cè)量等技術(shù)來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化過(guò)程。
圖3.USPIO標(biāo)記外泌體的體內(nèi)核磁共振成像
使用放射性同位素（如99mTc、125I等）標(biāo)記外泌體，通過(guò)放射性測(cè)量技術(shù)（如放射性計(jì)數(shù)或正電子發(fā)射斷層掃描）來(lái)追蹤外泌體的位置和內(nèi)部化情況。例如，研究人員用鋯 89 ( 89 Zr)標(biāo)記GMP級(jí)別外泌體的定量生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)，如圖4。與熒光或生物發(fā)光成像相比，放射性核素成像因其對(duì)深部組織成像的出色靈敏度和定量測(cè)量的潛力而為生物分子治療的體內(nèi)跟蹤提供了多種優(yōu)勢(shì)。
圖4.89Zr標(biāo)記外泌體不同注射時(shí)間在小鼠和大鼠體內(nèi)的定量分布
穩(wěn)定性
選擇具有良好穩(wěn)定性的染料，以確保染料在外泌體內(nèi)的持久性和可靠性；
選擇性
選擇能夠特異性地與外泌體結(jié)合的染料，以避免與其他細(xì)胞或細(xì)胞組分結(jié)合。
可觀察性
選擇能夠在所使用的觀察技術(shù)中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)的染料，以確保外泌體的可視化和檢測(cè)。
毒性
選擇對(duì)細(xì)胞和外泌體沒(méi)有或很低毒性的染料，以避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。
常用的外泌體染料包括熒光染料（如DiI、DiO、PKH67等）和蛋白質(zhì)標(biāo)記染料（如CD63、CD81等抗體標(biāo)記染料）。這些染料可以通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和電子顯微鏡等技術(shù)來(lái)觀察和檢測(cè)外泌體。PKH可提供長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞熒光膜標(biāo)記，且無(wú)明顯毒性作用。膜染料PKH67是一種綠色熒光染料，其激發(fā)（490 nm）和發(fā)射（504 nm）波長(zhǎng)與熒光素和FITC相近。PKH26是紅色光譜中的熒光染料，其峰值激發(fā)（551 nm）和發(fā)射（567 nm）波長(zhǎng)特性與羅丹明或藻紅蛋白（PE）檢測(cè)通道兼容，并且也可以被488 nm激光激發(fā)。目前PKH染料已成功用于體外和體內(nèi)跟蹤實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記外泌體和細(xì)胞外囊泡。例如，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，人脂肪組織源間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）釋放的外泌體可以通過(guò)熒光染料PKH26進(jìn)行標(biāo)記，并且這些標(biāo)記的外泌體可以釋放功能性的neprilysin，從而對(duì)腫瘤具有治療效果。
總的來(lái)說(shuō)，外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中也有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因?yàn)樗鼈兒胸S富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測(cè)臨床狀態(tài)，治療反應(yīng)，疾病進(jìn)展等，同時(shí)由于它們具有遞送生物分子的功能，因此它們還有發(fā)展成臨床藥物遞送載體的潛力
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Hieff® exosome tracker kit (for red fluorescence)外泌體紅色熒光示蹤試劑盒 | 40780ES | 20 µL |
Hieff® exosome tracker kit(for green fluorescence)外泌體綠色熒光示蹤試劑盒 | 40781ES | 20 µl |
Hieff® Quick exosome isolation kit(for Cell Culture Media) 細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體快速抽提試劑 | 41201ES | 25 mL/50 mL |
Hieff® Serum-free medium(for exosome) 外泌體專(zhuān)用無(wú)血清培養(yǎng)基 | 41210ES | 50 mL/500 mL |
Hieff® Quick exosome isolation kit Plus(for Cell Culture Media) 細(xì)胞培養(yǎng)上清外泌體快速提取分離試劑盒 | 41205ES | 10 T/20T |
Hieff® Quick exosome isolation kit Plus(for Serum/Plasma) 血清/血漿外泌體快速提取分離試劑盒Plus | 41206ES | 30 T |
Hieff® Quick exosome isolation kit（for Serum/Plasma）血清/血漿外泌體快速抽提試劑盒 | 41202ES | 30 mL |
Exosome identification kit for Western Blot 外泌體鑒定試劑盒 | 41203ES | 5 T |
文獻(xiàn)參考:
[3]Polanco JC, Li C, Durisic N, Sullivan R, G?tz J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
[4]Ren R, Tan XH, Zhao JH, Zhang QP, Zhang XF, Ma ZJ, Peng YN, Liu QB, Zhang HY, Li YQ, He R, Zhao ZQ, Yi XN. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome uptake and retrograde transport can occur at peripheral nerve endings. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
