類器官實驗技巧問答集

Q&A

Q: 類器官是由單一種類細胞組成的還是多細胞組織？
類器官（Organoids）指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養(yǎng)而形成的具有一定空間結構的組織類似物。類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行誘導后分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝成具有一定空間結構，形態(tài)和功能與體內相應器官相似的組織類似物。

Q: 類器官培養(yǎng)其樣本來源有哪些類型？
（1）多能干細胞來源的類器官包括：成體干細胞 (ASC)/多能性干細胞 (PSC) /以及誘導多能干細胞(iPSC)。
（2）組織提取細胞來源的類器官，常見于腫瘤組織。

Q：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織進行3D培養(yǎng)嗎？
可以，但對凍存組織的大小有較高要求，且原代凍存組織及細胞活性會明顯下降，從而導致后續(xù)培養(yǎng)成功率大大降低。

Q：類器官如何進行凍存和復蘇？
類器官的最好選擇在P2-P5代次時凍存，此時類器官活性和分化性能都是優(yōu)狀態(tài)。類器官的復蘇可以參考細胞的復蘇方法

Q：培養(yǎng)的類器官尺寸需要進行控制嗎，太大會好嗎？
需要，最好控制在500um以內，類器官內部缺乏血管及氣液循環(huán)系統(tǒng)。

當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多

Q：培養(yǎng)類器官除了使用基質膠，還可以使用什么？
除了使用基質膠，還可以使用①去細胞外基質和其他衍生蛋白質②合成水凝膠③工程化重組蛋白凝膠等進行替代。

Q:如何實現類器官的進行定向分化？
干細胞誘導分化的類器官早期發(fā)育過程受到多種信號通路的共同調控。在體外培養(yǎng)中，需要通過添加細胞因子來模擬這些信號通路的活動，以引導細胞在特定的方向分化。例如，通過Y27632、Activin A誘導可以將胚胎干細胞（PSCs）或多能干細胞（iPSC）分化為內胚層細胞（EB），再通過Wnt3a、FGF-4和Noggin等因子調控信號通路，從而誘導干細胞細胞向特定方向分化。

Q：獲取臨床樣本，如何避免污染？
① 取材時盡量保證無菌取材；
② 提取前可以用含雙抗的pbs浸泡幾分鐘：常見與外界環(huán)境有接觸可能的胃、腸、膀胱等位置腫瘤建議用含3%-5%雙抗的pbs浸泡5-10min，其他常見腫瘤用含1%-2%雙抗的pbs浸泡5min左右；
③提取細胞過程中所用試劑均加1%雙抗及合適濃度的原代抗生素。

Q:腫瘤組織采集、保存、運輸注意事項
盡可能多采集腫瘤細胞含量高的腫瘤組織，并縮短組織樣本在空氣中暴露的時間，以減少污染概率；采集的腫瘤組織樣本盡快置于裝有專用樣本保存液的無菌管中，低溫（4 ℃左右）下快速運轉至檢測單位（盡量保證采樣后2~4 h內送到）；

Q：病灶和癌旁培養(yǎng)出的類器官有區(qū)別嗎？腫瘤組織的取材部位有什么要求？
有差別，腫瘤本身具有異質性，不同來源的類器官之間存在差異是很常見的現象，從形態(tài)上看，原發(fā)病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結構，一般病灶形態(tài)上更加不規(guī)則一些。如果希望在建?；蛩幬锖Y選方面盡量減小誤差，可以在活性好的地方多位置取樣。

Q： 可用于腫瘤類器官藥物敏感性檢測的藥物類型？
臨床主要的抗腫瘤藥物類型可歸納為三大類，包括細胞毒物（化療藥物如紫杉醇、順鉑/卡鉑、5-FU 等）、靶向藥物（靶向EGFR、HER2、VEGFR等靶點的藥物）以及以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療藥物（PD-1抗體、PD-L1抗體等）

Q：PDO培養(yǎng)的成功率是多少？
不同類型來源的PDO在培養(yǎng)過程中的成功率略有不同，大部分的PDO培養(yǎng)成功率在63%至70%之間，甚至更高，達到90%，這跟組織本身活性相關性比較大。此外，臨床治療對于成功率的統(tǒng)計結果有一定影響。通過縮短樣本的離體時間和操作步驟，可以適當提高成功率。

Q：冰凍組織可以用于類器官培養(yǎng)？
一般不建議組織冷凍保存，活率損失會比較大，但如果冷凍保存在-80℃條件下，最佳的類器官培養(yǎng)窗口是在保存后的6周內，如果組織保存在液氮中，其保存時間可以更長但最好不要超過半年。

Q：原代細胞提取時，通常會混有成纖維細胞，應如何處置？
（1）可以根據成纖維細胞貼壁不牢的特性，采用反復貼壁的方式去除大部分成纖維細胞。
（2）采用成纖維細胞去除試劑，但是否會影響類器官的培養(yǎng)還需要實驗驗證。

Q：培養(yǎng)腫瘤類器官需要多大原始腫瘤組織比較好？活檢樣本量足夠嗎？
手術組織所需的原始腫瘤組織大小通常應大于2-3顆黃豆大?。蝗羰褂么┐袒顧z方式獲取樣本，則至少需要2-3條穿刺樣本，而內鏡活檢需要至少鉗取6顆以上腫瘤組織。

Q：樣本腫瘤組織偏小，培養(yǎng)的類器官數目不足以進行后續(xù)檢測，怎么辦？
由于腫瘤來源的類器官在傳代后可能會出現表型上的差異，一般不建議進行傳代。文獻中一般推薦將類器官的傳代控制在2-3代，并且最多不超過5代。如果細胞數目太少，經過5代的傳代仍然無法滿足測試需求，可以考慮改變檢測方式，例如將96孔板換成更小的384孔板，甚至嘗試使用微流控芯片等更小的體系進行測試。

Q：腫瘤組織中會存在正常細胞嗎？怎么去除這些正常細胞？
會存在少部分正常細胞，首先是取材時盡量避免取到正常組織，其次，提取原代細胞后可以進行磁珠分選或流式分選后再進行類器官培養(yǎng)。極少量存在正常細胞時，對后續(xù)類器官建模培養(yǎng)影響不大，也可不去除。

Q：從腫瘤組織中提取原代細胞，為什么細胞呈紅色？
組織在體內時供血豐富，存在較多紅細胞，不是很多的情況下不用處理，不影響類器官培養(yǎng)，較多紅細胞時可以適當用裂紅液處理后再進行培養(yǎng)。

Q：類器官培養(yǎng)過程中發(fā)現有黑色小顆粒，如何去除？
黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：
1、將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；
2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養(yǎng)基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質

Q：類器官傳代有次數限制嗎，可以進行多少次傳代？
傳代次數一般由來源細胞性質決定，大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月），培養(yǎng)基條件的選擇也可能會有一定影響，條件培養(yǎng)基一般會優(yōu)于合成因子培養(yǎng)基。

Q：腫瘤細胞系（如HepG2細胞系）可以培養(yǎng)成為PDO嗎？
PDO是復雜的自組裝結構，單一細胞系形成的3D培養(yǎng)體系無法稱之為PDO，只能是稱為3D球狀態(tài)。

Q：類器官傳代的標準是什么？
依據類器官的發(fā)育狀況，不同類器官時間不同，通常5-10日、直徑100-200um左右可以傳代，有些發(fā)育慢的可能要數周才能發(fā)育到適合傳代狀態(tài)。

Q：活類器官數量如何進行計數
實驗時,取出已經配置好的鈣黃綠素儲存液,加入鈣綠黃素溶液到培養(yǎng)基中至終濃度為0.2μmol/L。隨后在 37℃條件下孵育 60 min。到達時間后,用 PBS緩慢清洗掉帶有鈣綠黃素的培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基。用 490 nm 激發(fā)波長,515 nm 發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察類器官并拍照?；铑惼鞴僭跓晒怙@微鏡下顯示為綠色且邊緣清晰。對直徑>20μm的活類器官計數。

Q：類器官存活率的計算

類器官存活率按照公式進行計算:   X=(N活/N總)x100%     其公式中:
X——代表類器官存活率;
N活——代表活類器官數量;
N總——代表總類器官數量。

Q：鑒定類器官的方法有哪些？
最基礎的通過顯微鏡和H&E染色觀察類器官形態(tài)；進一步可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官與源組織的基因匹配度；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

Q：正常細胞是否也會生長為類器官？腫瘤類器官培養(yǎng)時怎么去除正常類器官？
正常細胞也可生長為類器官，去除正常類器方法：①依據HE鑒定結果的形態(tài)顯微鏡下手動篩選；②通過調節(jié)培養(yǎng)基組分（細胞因子/小分子抑制劑等）進行篩選純化PDO；③將PDO分散為單細胞后進行流式或磁珠分選。

Q：進行藥敏實驗時，需要將PDO從基質膠中消化下來嗎？
不需要，PDO需要有三維結構才能模擬體內情況。如果沒有基質膠的支持，藥物敏感性實驗的準確性將受到影響。一般溶解性藥物均可穿透基質膠作用于類器官，但進行免疫殺傷實驗時，是需要去除基質膠的。

Q：PDO實驗可以全代替動物模型（PDX）嗎？
能部分替代PDX，不可以全替代，動物模型可以更好的模擬藥物代謝、腫瘤浸潤和轉移及一些更為復雜的病理過程。是PDC，PDO無法替代的。

Q：在培養(yǎng)過程中，PDO生長情況與之前相比異常，主要表現為生長周期變短，增殖迅速，這是什么原因？
外因：①這種異常可能是由某些雜質細胞（如成纖維細胞）的大量生長引起的。在這種情況下，建議進行切片染色并觀察，以確定是否存在這些細胞的污染再進一步去除；②培養(yǎng)基條件改變，某些因子或小分子的加入可以進一步激活PDO的增殖通路。

內因：可能的基因突變。為了驗證這一點，最好進行測序，并將結果與初代PDO進行比對，以確定是否存在基因突變。

Q：怎樣檢測PDO對藥物的敏感性？
可以通過CCK8檢測、ATP細胞活性檢測、活死染色法等對類器官進行藥物敏感度檢測。檢測腫瘤類器官的ATP活力值是常用的方法。ATP是細胞內最重要的能量分子，可以用來衡量細胞新陳代謝水平，反映活細胞的數目。基于給藥對細胞ATP含量的影響，進一步利用分析軟件計算每組藥物方案的IC50值（被測藥物的半抑制濃度），來篩選出對腫瘤抑制藥物。

Q：PDO和腫瘤原代細胞的藥敏實驗濃度范圍相同嗎？
不相同，通常PDO的給藥濃度要高于原代細胞，在正式藥敏實驗時可以先進行預實驗分析。

Q：類器官一般長到什么程度可以用來進行藥物測試？
一般推薦藥物測試選用5代以內的類器官，此時的類器官遺傳穩(wěn)定性和活性都是好的。

Q：類器官建立是否成功有怎樣的標準嗎？
①最早期的初步判斷：類器官的形態(tài)改變從細胞狀態(tài)分化出空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等形態(tài)。②通過鑒定特定的生物標志物是否表達，并與組織切片的分布相似。進一步的可以進行測序分析以獲得更詳細的比對信息來判斷。

Q：類器官培養(yǎng)和普通細胞培養(yǎng)有何不同之處？
（1）細胞培養(yǎng)方式不同：類器官需要借助基質膠或空間結果等支撐物來維持其三維結構，而普通細胞培養(yǎng)則不需要；

（2）類器官的培養(yǎng)需要實現體外分化和自組裝，因此需要使用多種細胞因子的組合誘導，所需培養(yǎng)基成分相對復雜。而普通細胞培養(yǎng)通常只涉及單一類型的細胞，所以培養(yǎng)基成分相對簡單；

（3）細胞來源不同：類器官的細胞來源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養(yǎng)適用于培養(yǎng)多種類型人為篩選細胞。

Q：我培養(yǎng)出的3D球不知道是不是類器官，怎么判定與目標組織具有一致性？
類器官鑒定方法包括HE染色、ICH、單細胞測序等多種方法，需要從形態(tài)學、組織病理學及分子遺傳學等多維度進行判定是否與目標類器官或組織一致，如果是腫瘤類器官可以通過檢測標志物判斷，下表節(jié)選自NCCN指南和相關文獻僅供參考：

Q: 按照文獻方法進行類器官培養(yǎng)，觀察到類器官的形態(tài)與文獻有差異，是什么原因？

首先，不同個體樣本來源差異和分型不同且也存在異質性；其次，選用的細胞因子及一些小分子抑制劑的品質是否有差異都有可能導致不同類器官分化形態(tài)。建議通過HE，IHC，基因測序等方法與源組織確定類器官形態(tài)與源組織是否具有一致性，并不一定局限于文獻形態(tài)。

Q：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？

需要，一般藥敏實驗要求dmso的體積含量小于0.5%。

Q：類器官怎么從基質膠中回收？

①比較推薦：市售有類器官回收液（CAT#41421ES），可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

②低溫融解基質膠，利用基質膠本身性質低溫使基質膠軟化釋放類器官。

Q：在類器官回收時，會有不少類器官粘附在離心管壁，如何提高回收率？

收集后離心時用水平轉子離心機，可以適當提高一點離心機轉速，一般300g左右離心力，轉速大概是1000-1200rpm。

參考文獻：

【1】王樹濱,高靜,朱宇等.類器官藥物敏感性檢測指導腫瘤精準治療臨床應用專家共識(2022年版)[J].中國癌癥防治雜志,2022,14(03):234-239.
【2】團體標準：T/CSCB 0014-2022，人腸癌類器官
【3】團體標準：T/CSCB 0013-2022  人腸道類器官
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