圖1. 2020年諾貝爾化學獎得主[1]

CRISPR是“成簇規(guī)律間隔短回文重復序列"(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的縮寫，CRISPR系統(tǒng)是原核生物（包括細菌和古生菌）的一種天然防御機制，用于抵御噬菌體病毒的感染。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由兩個部分：CRISPR基因序列與Cas基因組成。

CRISPR基因序列

由前導序列(leader)、重復序列(repeat)和間隔序列(spacer)構(gòu)成：

1）前導序列：一段富含AT堿基的數(shù)百個堿基對，坐落于CRISPR基因的上游，并發(fā)揮著啟動子的關(guān)鍵作用。

2）間隔序列：細菌所俘獲的外源DNA片段的記錄，它們像是CRISPR系統(tǒng)的“記憶庫"，當相同的外源遺傳物質(zhì)再次嘗試入侵時，CRISPR/Cas系統(tǒng)會精準地識別并予以打擊。

3）重復序列：長度約20–50bp堿基，內(nèi)含5–7bp的回文序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定RNA的整體二級結(jié)構(gòu)。這些重復序列與間隔序列相互交錯，數(shù)量從幾個到數(shù)百個不等。

cas基因

Cas基因，位于CRISPR基因附近或散布于整個基因組的其他位置，它們所編碼的蛋白質(zhì)包括Cas1至Cas10等。這些蛋白質(zhì)在CRISPR/Cas系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，與CRISPR基因序列協(xié)同工作，共同構(gòu)成了這一強大的防御機制，從而保護原核生物免受噬菌體病毒的侵害。

圖2. CRISPR位點結(jié)構(gòu)圖[2]

CRISPR/Cas系統(tǒng)，根據(jù)其Cas蛋白的組成差異以及效應復合物的特性，可以被分為兩大類：Class1和Class2。

Class1系統(tǒng)：

這個類別的系統(tǒng)特征在于它包含一個由多個Cas蛋白構(gòu)成的效應模塊。該模塊承擔著識別目標基因組、失活入侵DNA以及處理前CRISPR RNA（也稱為pre-crRNA）的關(guān)鍵任務。

Class2系統(tǒng)：

與Class1不同，Class2系統(tǒng)的標志性特征是它包含一個單一的多結(jié)構(gòu)域CrRNA結(jié)合蛋白，比如在Class2系統(tǒng)中的Cas9。這種蛋白質(zhì)具備實現(xiàn)干擾所需的全部活性，并且在一些變體中，它還整合了參與前crRNA加工的活性。

圖3. CRISPR系統(tǒng)分類[3]

CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas基因可以歸納為四個不同但部分重疊的功能模塊：適應模塊、表達處理模塊、干擾或效應模塊、信號轉(zhuǎn)導或輔助模塊，這些模塊共同協(xié)作以實現(xiàn)其基因組編輯的能力。

1）適應模塊：負責將新的遺傳信息整合到CRISPR序列中。它包括編碼關(guān)鍵酶Cas1（負責間隔序列的插入）和適應復合體亞單位Cas2的基因。此外，它還可能包含Cas4核酸酶、II-A亞型中的Csn2蛋白以及許多III型系統(tǒng)中的逆轉(zhuǎn)錄酶。

2）表達處理模塊：負責前crRNA處理。在大多數(shù)Class1系統(tǒng)中，Cas6是直接負責這一過程的酶。而在II型系統(tǒng)中，這一任務由細菌RNase III（一種非Cas蛋白）完成。在許多V型系統(tǒng)和所有VI型系統(tǒng)中，大型效應Cas蛋白內(nèi)含一個專門的催化中心來處理前crRNA。

3）干擾或效應模塊：涉及目標識別和核酸裂解。在Class1系統(tǒng)中，效應蛋白模塊由多種Cas蛋白組成，如Cas3、Cas5-Cas8、Cas10和Cas11等。而在Class2系統(tǒng)中，效應蛋白模塊簡化為單一的大蛋白，如Cas9、Cas12或Cas13。

4）信號轉(zhuǎn)導或輔助模塊：這是一個包含眾多CRISPR連鎖基因的廣泛集合，它們在CRISPR-Cas系統(tǒng)中的作用大多是初步預測的。

由于Class2系統(tǒng)的簡便性和易用性，研究者主要關(guān)注Class2系統(tǒng)中的Cas亞型，以尋找潛在的新基因組編輯和診斷工具。Class2 CRISPR-Cas系統(tǒng)主要包括三種類型：II型（cas9）、V型（cas12）和VI型（cas13）。

II型系統(tǒng)

Ⅱ型系統(tǒng)中的代表為CRISPR/Cas9蛋白系統(tǒng)，Cas1、Cas2、Cas4蛋白負責重復間隔區(qū)的建立，RNaseⅢx協(xié)助crRNA的形成，而剩余的工作由Cas9蛋白完成。Cas9發(fā)揮功能時需要tracrRNA與crRNA共同作用（tracrRNA促進crRNA加工成熟，通過堿基配對與crRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合，用于結(jié)合Cas9蛋白；crRNA與基因組DNA互補配對，用于結(jié)合模板DNA），當向?qū)NA與Cas9蛋白形成復合物后，Cas9蛋白的兩個DNA切割結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）發(fā)揮切割活性，HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補的鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域切割另一條鏈，從而實現(xiàn)了對目標DNA的雙鏈切割，這種精準的切割能力使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為了基因編輯領(lǐng)域中強大、高效的工具之一。

V型系統(tǒng)

V型系統(tǒng)的單一效應蛋白為Cas12，與II型系統(tǒng)存在顯著差異。II型系統(tǒng)依賴于兩個DNA切割結(jié)構(gòu)域——HNH和RuvC，而V型系統(tǒng)則僅擁有一個與RuvC相似的切割活性結(jié)構(gòu)域；在guideRNA上，Cas9系統(tǒng)需要tracrRNA與crRNA的協(xié)同作用，而Cas12a系統(tǒng)則僅憑單一的crRNA便能完成使命。

值得一提的是，Cas9蛋白在切割雙鏈DNA后，產(chǎn)生的DNA末端為平末端。相比之下，Cas12a系統(tǒng)則會產(chǎn)生粘性末端，這一特性為其在基因編輯和核酸檢測等領(lǐng)域的應用提供了更多可能性。

此外，像Cas12a、Cas12b這樣的系統(tǒng)還具有反式切割活性。在crRNA的引導下，Cas12a能夠特異性地識別和切割雙鏈DNA（dsDNA），并隨后釋放單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）活性。這種活性使得Cas12a能夠無差別地裂解附近的單鏈DNA（ssDNA）。因此，Cas12a系統(tǒng)可以與LAMP等技術(shù)相結(jié)合，為核酸檢測等領(lǐng)域提供強大的工具。

圖4. 主要的CRISPR/Cas基因編輯工具[4]

VI型系統(tǒng)

VI型系統(tǒng)的單一的效應蛋白為Cas13，具有靶向切割目標RNA的能力。Cas13含有兩個高等真核生物和原核生物核苷酸(HEPN)結(jié)合域結(jié)構(gòu)，其上的RxxxxH保守基序是Cas13核酸酶催化活性位點。Cas13僅憑單個crRNA的引導，便能催化自身的前體pre-crRNA轉(zhuǎn)化為成熟的crRNA，當crRNA-Cas13a復合物形成時，crRNA便會引導復合物與靶標RNA進行堿基互補配對。通過這種機制，Cas13能夠特異性地對靶標RNA進行順式剪切，從而實現(xiàn)RNA敲除的目的。此外，Cas13還能以非特異性的方式對附近的RNA進行反式剪切，這一特性使其在基因編輯和RNA調(diào)控領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

CRISPR/Cas系統(tǒng)的具體作用機可分為以下三個階段：

當被外源噬菌體或質(zhì)粒侵入時，含有CRISPR的細菌和古菌獲得插入間隔區(qū)的外源DNA片段；

當與間隔區(qū)同源的外來核酸再次進入細菌時，CRISPR陣列會被激活并轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA（pre-crRNA）。同時，與pre-crRNA序列互補的tracrRNA也會被轉(zhuǎn)錄出來，tracrRNA在轉(zhuǎn)錄后會首先與Cas9蛋白結(jié)合，隨后與pre-crRNA通過互補堿基配對形成雙鏈RNA。這個雙鏈RNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成一個功能強大的復合物。

在RNase III的作用下，pre-crRNA經(jīng)歷初級和二次加工，多余的重復序列和間隔序列被去除，從而生成成熟的crRNA。這個成熟的crRNA具備了靶向特定DNA鏈的能力。

若細菌再次遭受同源DNA的感染，它會啟動CRISPR區(qū)域的轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過一系列的加工和成熟過程，生成單鏈向?qū)NA（sgRNA），sgRNA會引導Cas9蛋白精確地剪切并破壞同源間隔區(qū)域的DNA鏈，導致雙鏈DNA斷裂（DSB），隨后，細胞會通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）的方式對靶基因進行修復。這一過程中，CRISPR/Cas系統(tǒng)展現(xiàn)出了其精確的靶向干擾能力，從而有效地抵御了外源遺傳物質(zhì)的入侵。

圖5. CRISPR-Cas9介導的DNA干擾細菌適應性免疫[5]

RISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)依賴于兩大核心組件：具備導向功能的gRNA和Cas9蛋白。其技術(shù)原理涵蓋了兩個基本過程：gRNA引導的Cas9靶向DNA切割，以及隨后的DNA修復。

在Cas9靶向DNA切割階段，CRISPR系統(tǒng)識別DNA上的特定位置，這一識別過程依賴于crRNA（負責識別）和tracrRNA（作為Cas9的結(jié)合支架）的序列。當這兩者融合轉(zhuǎn)錄出sgRNA后，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復合體，通過sgRNA與20bp靶序列的互補配對，Cas9核酸內(nèi)切酶被精確引導至靶切割位點，切割從PAM（即復合體識別的富含GC的三堿基序列，如5′-NGG-3′）上游的第三個堿基開始。Cas9核酸內(nèi)切酶包含兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域和RuvC-like核酸酶結(jié)構(gòu)域。這兩個結(jié)構(gòu)域協(xié)同工作，共同切割DNA。其中，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域負責切割與crRNA互補的DNA鏈，而RuvC-like結(jié)構(gòu)域則切割另一條非互補鏈。切割位點位于PAM上游原始間隔序列的第3和第4個核苷酸之間，產(chǎn)生平末端的DSB（雙鏈斷裂）。一旦Cas9/sgRNA復合物誘導產(chǎn)生DSBs，機體將啟動兩種修復方式，從而實現(xiàn)對靶基因表達的精準調(diào)控。

圖6. CRISPR-Cas9介導的基因編輯機制[6]

1）非同源末端連接（NHEJ）

非同源末端連接（NHEJ）是修復雙鏈斷裂（DSB）的經(jīng)典通路。在這一過程中，斷端會經(jīng)歷核酸酶的精細修剪和DNA聚合酶的空隙填補，然而，這種修復方式會在DNA上留下“痕跡"，可能是修復過程中錯誤插入或缺失的堿基。當這些“痕跡"出現(xiàn)在基因組的編碼蛋白基因區(qū)域時，會導致基因編碼的蛋白序列出現(xiàn)異常，進而造成相應蛋白功能的失調(diào)。

然而如果“痕跡"出現(xiàn)在基因組的非編碼區(qū)，其對細胞的整體功能通常不會造成顯著影響。例如，在基因敲除實驗中，我們常常選擇在翻譯起始位點后的外顯子區(qū)域設(shè)計gRNA，以確保其盡可能靠近mRNA的5’端。這樣做的目的是，插入或缺失的堿基會干擾正常的密碼子讀碼，導致翻譯過程提前終止，從而破壞目標基因的表達或使其功能喪失。

2）同源重組修復（HDR）

同源重組修復（HDR）是一種基于遺傳重組的DNA修復機制，它發(fā)生在兩個相似或相同的DNA分子核苷酸序列之間。HDR的一個顯著特點是，在修復過程中不會引入額外的核苷酸缺失或增加，因此它能夠精確地修復DNA雙鏈的斷裂。例如，在制備疾病相關(guān)突變模型時，我們可以通過外源提供包含所需突變的靶基因模板，然后利用HDR機制，在Cas9蛋白切割DNA后，將突變模板精確地整合到基因組中。

CRISPR/Cas技術(shù)作為新一代基因編輯技術(shù)的代表，具有極為廣闊的應用前景。在本文中，我們向大家介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本組成和編輯機制。而在接下來的文章中，我們將深入探討CRISPR/Cas技術(shù)的遞送形式及應用，敬請期待！