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在探索生命科學(xué)的奧秘中，紫杉醇這一神奇的藥物始終占據(jù)著舉足輕重的地位。作為一種抗擊癌癥的利器，紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它由一個(gè)高度活躍的碳骨架和一條帶有苯基異亮氨酸的側(cè)鏈構(gòu)成。然而，正是這種構(gòu)造，使得紫杉醇的合成之路充滿了挑戰(zhàn)。
研究人員對(duì)紫杉醇的生物合成路徑進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)半個(gè)世紀(jì)的研究，但仍有許多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化步驟隱藏在迷霧之中。特別是，氧化四環(huán)烷環(huán)的形成和C9位碳原子的氧化過(guò)程，至今仍是一個(gè)未解之謎，它們像兩座高峰，阻擋在我們理解紫杉醇合成路徑的道路上。
在這條合成路徑中，找到負(fù)責(zé)氧化四環(huán)烷環(huán)和C9位氧化的關(guān)鍵酶，就像是找到了一把鑰匙，能夠?qū)⒆仙即忌锖铣傻母鱾€(gè)孤立環(huán)節(jié)串聯(lián)起來(lái)，形成一條完整的鏈條。
隨著紫杉醇在癌癥治療中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，市場(chǎng)對(duì)它的需求也在不斷攀升。然而，目前依賴天然資源提取的半合成生產(chǎn)方法，已經(jīng)無(wú)法滿足這種日益增長(zhǎng)的需求。這就像一條狹窄的通道，無(wú)法承載日益增多的行人。
幸運(yùn)的是，合成生物學(xué)的興起為我們提供了一條新的道路。通過(guò)合成生物學(xué)，我們有望實(shí)現(xiàn)紫杉醇的綠色、可持續(xù)生產(chǎn)。因此，揭開(kāi)紫杉醇生物合成路徑的神秘面紗，不僅能夠滿足市場(chǎng)需求，更能夠推動(dòng)合成生物學(xué)的發(fā)展，開(kāi)啟一個(gè)全新的綠色制藥時(shí)代。
2024年1月26日，國(guó)際頂級(jí)期刊Science(IF:56.9)在線發(fā)表了基因組所閆建斌研究員與北京大學(xué)雷曉光教授等合作完成的最新研究：“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III"。該研究不僅揭示了紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵酶和步驟，而且為合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇提供了新的策略和方法，有助于減少對(duì)天然資源的依賴，滿足市場(chǎng)對(duì)紫杉醇不斷增長(zhǎng)的需求。該研究成果標(biāo)志著我國(guó)在紫杉醇合成生物學(xué)理論和技術(shù)方面位于地位。
研究思路
環(huán)氧化催化關(guān)鍵酶-TOT1的解析
在探索紫杉醇這一神奇藥物的背后，研究人員采取了一系列精妙的實(shí)驗(yàn)步驟，揭示了TOT1基因在氧化環(huán)形成中的關(guān)鍵角色。首先，他們運(yùn)用了一種巧妙的篩選策略。基于紫杉烷生物合成途徑的知識(shí)，研究人員將CYP725A家族的基因分為三個(gè)小組，并在煙草葉片中同時(shí)表達(dá)了這三組基因。隨后，他們使用液相色譜質(zhì)譜分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)底物的氧化產(chǎn)物。
接著，他們進(jìn)行了活性篩選。在表達(dá)了第二組基因的葉片中，研究人員觀察到了明顯的底物氧化產(chǎn)物峰，這表明該組基因中可能含有他們尋找的酶。
為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員單獨(dú)表達(dá)了第二組中的每一個(gè)基因。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Chr9_74725878基因被表達(dá)時(shí)，底物氧化產(chǎn)物的數(shù)量顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)證明了該基因編碼的蛋白質(zhì)具有催化氧化環(huán)形成的能力。
基于這一發(fā)現(xiàn)，該基因被命名為TOT1，并通過(guò)體外表達(dá)和底物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其功能。
為了深入了解TOT1的作用機(jī)理，研究人員運(yùn)用了結(jié)構(gòu)模擬和反應(yīng)機(jī)理計(jì)算的方法。他們的研究揭示了TOT1介導(dǎo)的氧化環(huán)形成反應(yīng)機(jī)理，即它能直接將烯基轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和氧化環(huán)。
最后，為了驗(yàn)證TOT1在紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵作用，研究人員在紫杉植物中敲低了TOT1的表達(dá)。他們觀察到，百菌素和紫杉醇的含量隨之降低，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了TOT1在紫杉醇生物合成中的重要性。
（圖片來(lái)自原文）
紫杉醇氧化烷基環(huán)形成機(jī)制
TOT1是一種具有雙重功效的氧化酶。能夠?qū)⒆仙即贾械南┗苯愚D(zhuǎn)化為環(huán)氧化物，進(jìn)而形成氧化烷基環(huán)。這一過(guò)程無(wú)需經(jīng)過(guò)環(huán)氧化物作為中間體的傳統(tǒng)路徑，而是通過(guò)一種更為直接和高效的轉(zhuǎn)化方式。
在TOT1的催化下，烯基首先經(jīng)歷氧化反應(yīng)，形成環(huán)氧化物。然而，這個(gè)環(huán)氧化物并非故事的終點(diǎn)，而是通過(guò)一系列結(jié)構(gòu)重排，最終演變成為氧化烷基環(huán)。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了人們對(duì)氧化烷基環(huán)形成機(jī)制的傳統(tǒng)認(rèn)知，為理解紫杉醇的生物合成過(guò)程帶來(lái)了新的視角。
（圖片來(lái)自原文）
通過(guò)精確的計(jì)算模擬和深入的結(jié)構(gòu)分析，研究人員揭示了TOT1催化氧化烷基環(huán)形成的詳細(xì)反應(yīng)機(jī)理。他們觀察到了過(guò)渡態(tài)和中間體的形成，這些都是在TOT1催化下發(fā)生的微妙變化。
（圖片來(lái)自原文）
特別值得注意的是，模擬計(jì)算結(jié)果顯示，氧化烷基環(huán)產(chǎn)物的形成在能量上和動(dòng)力學(xué)上都是優(yōu)先的，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不謀而合。這一發(fā)現(xiàn)不僅驗(yàn)證了計(jì)算模型的準(zhǔn)確性，也為紫杉醇的生物合成提供了新的科學(xué)依據(jù)。
這一機(jī)制的創(chuàng)新之處在于，它打破了我們以往對(duì)環(huán)氧化物作為中間體形成氧化烷基環(huán)的認(rèn)知壁壘，為氧化烷基環(huán)的形成提供了全新的解釋。
C9羥基化酶的突破
研究人員采取了一系列精確的實(shí)驗(yàn)步驟，最終揭示了關(guān)鍵的C9羥基化酶T9αH1。
首先，研究人員對(duì)不同組織中的紫衫素含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)紫衫素主要在Taxus植物的根部積累，而在針葉和樹(shù)皮中的含量則相對(duì)較低。
接著，他們對(duì)紫衫素生物合成途徑中已知基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些基因在根部高度表達(dá)，與紫衫素的含量分布密切相關(guān)。
進(jìn)一步地，研究人員對(duì)CYP725A家族基因的組織特異性表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并從中篩選出了17個(gè)潛在的候選基因。
為了鑒定這些候選基因中是否含有合成紫衫素所需的C9羥基化酶，研究人員在煙草植物中逐一表達(dá)了這些候選基因，并同時(shí)表達(dá)了已知的紫衫素生物合成基因。他們通過(guò)檢測(cè)是否能夠合成紫衫素來(lái)評(píng)估這些候選基因的功能。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有Chr9_26460669基因的表達(dá)使得煙草能夠合成紫衫素。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了Chr9_26460669基因編碼了C9羥基化酶，并被命名為T9αH1。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證T9αH1的C9羥基化酶活性，研究人員在煙草中表達(dá)了T9αH1，并成功檢測(cè)到了紫衫素的生成。
通過(guò)這一系列精妙的實(shí)驗(yàn)步驟，研究人員不僅成功從候選基因中篩選并鑒定出了C9羥基化酶T9αH1，而且補(bǔ)了巴卡丁III生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵空白。
（圖片來(lái)自原文）
人工重建巴卡丁III生物合成途徑
研究人員首先在煙草葉片中同時(shí)共表達(dá)了已知參與巴卡丁III生物合成的基因，包括TXS、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TAT和TBT。
接著，他們?cè)谏鲜鲆阎虻幕A(chǔ)上，加入了新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)關(guān)鍵基因TOT和T9αH，為巴卡丁III的生物合成途徑增添了新的力量。
隨后，研究人員在煙草葉片提取物中檢測(cè)到了一個(gè)新產(chǎn)物峰，其質(zhì)譜和保留時(shí)間與巴卡丁III一致，這表明他們可能已經(jīng)成功合成巴卡丁III。
為了進(jìn)一步確認(rèn)這個(gè)新產(chǎn)物的身份，研究人員運(yùn)用了MS/MS分析技術(shù)，結(jié)果確認(rèn)該新產(chǎn)物確實(shí)是巴卡丁III。
為了鑒定巴卡丁III生物合成的核心途徑，研究人員逐一移除了每個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)所有9個(gè)基因同時(shí)表達(dá)時(shí)才能產(chǎn)生巴卡丁III，這證明了這9個(gè)基因構(gòu)成了巴卡丁III生物合成的核心途徑。
（圖片來(lái)自原文）
此外，他們還發(fā)現(xiàn)TAT不僅可以催化C10位的乙?；襎10βH在C10位氧化反應(yīng)中可以被T5αH等其他酶取代。
特別值得注意的是，盡管DBAT被認(rèn)為是C10位乙?；年P(guān)鍵酶，但研究人員發(fā)現(xiàn)，即使在沒(méi)有DBAT的情況下，巴卡丁III仍然可以合成，這表明TAT可能也具有C10位的乙?；δ?。
通過(guò)人工共表達(dá)關(guān)鍵基因，研究人員成功地在煙草中重建了巴卡丁III的生物合成途徑，為進(jìn)一步通過(guò)合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
核心基因的功能協(xié)同
在探索巴卡丁 III 生物合成過(guò)程的奧秘中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列核心基因之間功能協(xié)同性的顯著特征。首先，TOT、T9αH等基因主要在根部表達(dá)，與下游基因的表達(dá)模式相似，表明這些基因在組織水平上存在協(xié)同表達(dá)的現(xiàn)象。
其次，經(jīng)過(guò)茉莉酸處理后，這些基因的表達(dá)模式呈現(xiàn)協(xié)同上調(diào)的趨勢(shì)，與下游基因的表達(dá)模式相似，這提示茉莉酸可能參與協(xié)同調(diào)控這些基因。
此外，這些基因的表達(dá)之間存在顯著的正相關(guān)性，而與T14βH的表達(dá)模式不同，這表明它們之間存在協(xié)同調(diào)控關(guān)系。
在亞細(xì)胞水平上，這些酶主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中的酶存在協(xié)同作用，形成協(xié)同代謝途徑。
進(jìn)一步地，這些基因構(gòu)成的代謝網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀而非線性，形成協(xié)同的代謝途徑。
最后，這些基因在染色體上的分布位置存在關(guān)聯(lián)，暗示它們之間可能存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。
綜合來(lái)看，這些核心基因在表達(dá)模式、調(diào)控、亞細(xì)胞定位、代謝途徑等方面存在協(xié)同性，共同參與巴卡丁 III 的生物合成過(guò)程。
（圖片來(lái)自原文）
綜上所述，本研究確定了紫杉科植物中催化生成抗癌藥物紫杉醇的關(guān)鍵酶。紫杉醇的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含一個(gè)功能化的二萜核心骨架(巴卡丁III)和苯異戊烯酰基側(cè)鏈。盡管在過(guò)去五十年中進(jìn)行了大量的研究，但巴卡丁III的完整生物合成途徑仍不清楚。研究人員通過(guò)對(duì)紫杉醇生物合成途徑的篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)雙功能細(xì)胞色素P450酶TOT1,它催化了紫杉醇中氧雜環(huán)的形成。通過(guò)共表達(dá)其他已知的參與巴卡丁 III合成的基因，研究人員成功地在煙草中人工重建了巴卡丁 III的生物合成途徑。這項(xiàng)研究為利用合成生物學(xué)手段綠色高效制造紫杉醇提供了可能。
翌圣助力產(chǎn)品
在該研究中，研究團(tuán)隊(duì)使用了翌圣生物染料法熒光定量qPCR試劑進(jìn)行基因表達(dá)分析：
(圖片來(lái)自原文)
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[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
[11] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021;39(12):1581-1588. doi:10.1038/s41587-021-00982-9.(IF=68.164)
[12] Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regulates blood cholesterol levels in humans and mice. Cell Res. 2020;30(4):363-365. doi:10.1038/s41422-020-0303-z.(IF=46.297)
[13] Wang Z, Lu Z, Lin S, et al. Leucine-tRNA-synthase-2-expressing B cells contribute to colorectal cancer immunoevasion. Immunity. 2022;55(6):1067-1081.e8. doi:10.1016/j.immuni.2022.04.017.(IF=43.474)
[14] Bi Q, Wang C, Cheng G, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022;55(8):1466-1482.e9. doi:10.1016/j.immuni.2022.06.018.(IF=43.474)
[15] Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile Temperature Critically Controls the Differentiation and Pathogenicity of T Helper 17 Cells. Immunity. 2020;52(2):328-341.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.006.(IF=43.474)
[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
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