為了實現(xiàn)基因組編輯，CRISPR/Cas系統(tǒng)的組件需要進入靶細胞的細胞核中發(fā)揮作用，可以通過遞送不同形式的Cas和向導RNA（gRNA）來實現(xiàn)，包括質粒DNA（pDNA），mRNA或Cas核糖核蛋白（RNP）三種生物形式。

pDNA通常被用作非病毒DNA傳遞的載體，其介導的CRISPR技術是將Cas9蛋白和gRNA的基因序列融入單個或多個pDNA載體之中。因pDNA具有易構建、操作簡便以及成本效益高等優(yōu)點，成為了備受矚目的基因編輯方法。目前廣泛應用的Cas9質粒包含兩個表達盒，一個是密碼子優(yōu)化的Cas9，一個是嵌合的gRNA。與我們細胞內(nèi)遺傳信息的流動一致，含有CRISPR系統(tǒng)元件的pDNA需先進入細胞核，隨后轉錄成相應的mRNA，最后被轉移到細胞質中以啟動后續(xù)的蛋白質合成過程。

mRNA介導的CRISPR基因編輯技術，其核心在于將Cas9 mRNA與gRNA共同精準地遞送至靶細胞。相較于傳統(tǒng)的pDNA轉染方式，mRNA的遞送方式能夠更為迅速地啟動蛋白質表達過程。與pDNA的應用策略不同，基于mRNA的編輯策略要求同時遞送Cas9 mRNA和gRNA這兩種關鍵的組分。Cas9 mRNA的制備主要依賴于體外轉錄（IVT）技術，并經(jīng)過加帽和加尾修飾，以確保其穩(wěn)定性和翻譯效率。gRNA作為另一重要組件，存在雙鏈和單鏈兩種形式。雙鏈形式的gRNA由crRNA和tracrRNA共同構成，這兩部分需要通過退火過程形成穩(wěn)定的復合物。在實際應用中，可以通過化學合成的方式分別制備crRNA和tracrRNA，進而組裝成完整的雙鏈gRNA。而單鏈形式的gRNA則是將crRNA和tracrRNA巧妙地融合成一個單一的分子，無需退火過程。單鏈gRNA可以通IVT或化學合成的方式獲得，兩種方法各有利弊，可根據(jù)實驗需求進行靈活選擇。

IVT作為一種廣泛應用的gRNA生產(chǎn)方法，因其成本效益高、產(chǎn)量大以及操作簡便等優(yōu)點，在實驗室中得到了廣泛的推廣和應用?；瘜W合成gRNA是利用高通量化學合成平臺來完成的，通過在gRNA的5’和3’端各加入3個硫代和甲氧基修飾，不僅可以提高gRNA的穩(wěn)定性，還能有效降低脫靶效應，從而提高基因編輯的精確性和安全性。

在CRISPR/Cas系統(tǒng)的應用中，直接遞送Cas9蛋白與gRNA，從而繞過pDNA或mRNA在細胞內(nèi)部的轉錄與翻譯過程，無疑是實現(xiàn)高效基因編輯的優(yōu)選方法。這種基于蛋白的遞送方式同樣依賴于兩個核心成分：Cas9核酸酶與gRNA，首先將Cas9蛋白與gRNA結合，形成帶有負電荷的Cas9/gRNA核糖核蛋白（Cas9 RNP）復合物，隨后將Cas9 RNP作為單一組分進行遞送。這種技術不僅簡化了操作過程，更提高了基因編輯的效率和準確性。

圖1. CRISPR-Cas9的三種生物形式[1]

 

三種生物形式的差異

每種CRISPR系統(tǒng)的生物形式都有的物理、化學、生理特性。

Cas9 pDNA表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性，相比之下，mRNA的穩(wěn)定性較差，可通過對其核苷酸進行化學修飾提升mRNA的穩(wěn)定性。Cas9 RNP由蛋白質和gRNA組成，其結構使得它容易受到蛋白酶和RNases的降解，因此是最不穩(wěn)定的形式。

當Cas9的pDNA進入細胞后，它需經(jīng)過轉錄和翻譯的過程，最終產(chǎn)生Cas9蛋白。而Cas9的mRNA則更為直接，僅需被傳遞至細胞質中，便可啟動翻譯過程生成Cas9蛋白。隨后Cas9蛋白與gRNA組裝為復合體發(fā)揮編輯作用。相較之下，RNP形式能夠直接入核進行編輯，無需經(jīng)歷上述復雜的轉錄和翻譯過程。因此，遞送Cas9 RNP成為了細胞基因組編輯中最為直接且高效的策略，通常也被認為是最為理想的編輯方法。

在基因組編輯應用中，CRISPR/Cas復合物僅在基因組修飾發(fā)生期間暫時需要，其在細胞中過度存在會增加脫靶事件的風險。Cas9 RNP和mRNA在細胞內(nèi)的存在時間相對較短，有助于降低脫靶效應的潛在風險。而Cas9 pDNA能夠介導更長時間的基因表達，可能會增加脫靶編輯事件發(fā)生的風險。

由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于遞送基因編輯器到體內(nèi)的AAV系統(tǒng)的包裝上限約為4.7 kb，因此尋找更小的基因編輯系統(tǒng)對于其高效體內(nèi)遞送具有重要意義。目前不同的Cas系統(tǒng)均有小型Cas蛋白被開發(fā)，如Cas9系統(tǒng)中來自金黃色釀膿葡萄球菌中的SaCas9（1000多個氨基酸）；Cas12系統(tǒng)中的AaCas12b和BhCas12b（1100多個氨基酸）；Cas14(又稱Cas12f1，500個氨基酸) 、Cas12j（又稱CasΦ，700氨基酸）；Cas13系統(tǒng)中的Cas13bt（~800氨基酸），基因編輯已進入迷你時代。

CRISPR/Cas系統(tǒng)常見的三種應用模式pDNA、mRNA和RNP各有優(yōu)缺點。從張鋒、劉如謙的最新發(fā)文來看，未來RNP形式的蛋白遞送或將成為繼mRNA之后的下一個焦點。

表1.CRISPRs生物形式對比

CRISPR系統(tǒng)的三種遞送技術

CRISPR系統(tǒng)的生物形式各異，因此其遞送方法也呈現(xiàn)出多樣性。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送策略已發(fā)展出多種方法，主要分為三大類別：生物遞送方法、化學遞送方法以及物理遞送方法。

圖2. CRISPR技術不同的遞送方式[2]

在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，病毒載體扮演著至關重要的角色。其中，AAV、慢病毒以及桿狀病毒載體都是常用的遞送工具。值得一提的是，AAV已經(jīng)成為體內(nèi)基因治療領域廣泛應用的遞送載體，并成功獲得批準，遞送CRISPR組件至人體用于疾病治療。

AAV之所以備受青睞，源于它能夠輕易地跨越物種屏障感染細胞，同時其免疫原性極低，大大降低了引發(fā)炎癥反應的風險。然而，任何事物都有其局限性，AAV載體的最大包裝容量僅為4.7kb，這對于體積龐大的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)來說，無疑是一個巨大的挑戰(zhàn)。尤其是當Cas9蛋白攜帶效應蛋白時，更是需要采取特殊的修改措施，如使用體積較小的SaCas9或將遞送系統(tǒng)分割為兩個載體，才能實現(xiàn)在AAV載體中的有效加載。

慢病毒作為能感染分裂和非分裂細胞的逆轉錄病毒，也常用作遞送載體。由于慢病毒的10kb負載能力，整個CRISPR/Cas9系統(tǒng)都可以加載到其中，但慢病毒隨機整合入宿主基因組可能引發(fā)免疫反應，甚至致癌。

盡管病毒載體遞送系統(tǒng)已將CRISPR技術應用于臨床，但其療效仍受限于多重因素，如患者免疫反應、載荷大小限制、重復給藥難度及長期基因表達等問題。因此，科研人員正積極探索新的遞送策略，其中LNP-mRNA等非病毒系統(tǒng)備受矚目。

脂質載體是一種很有前景的CRISPR-Cas9系統(tǒng)遞送載體，通常由四種脂類組成：陽離子型（或電離型）脂類、聚乙二醇脂類、輔助磷脂和膽固醇。LNP的核心技術在于其具有pH依賴性的陽離子化脂質。在遞送階段，這種脂質能夠在中性pH環(huán)境下保持中性狀態(tài)，與周圍的成分和諧共處。然而，一旦進入酸性環(huán)境，如細胞內(nèi)的內(nèi)體，它便會迅速轉變?yōu)殛栯x子狀態(tài)。這種電荷狀態(tài)的轉變不僅能夠誘導粒子解離，還能夠破壞核內(nèi)體膜，從而大大增強其從核內(nèi)體逃逸的能力。這種機制不僅提高了遞送效率，還有效地降低了全身毒性，使得LNP成為一種安全且高效的遞送工具。

目前，已有多款基于LNP-RNA的療法成功獲得FDA的批準，這充分證明了LNP技術在實際應用中的可行性和有效性。

圖3. LNP組成[2]

盡管LNP在臨床實踐中已展現(xiàn)出作為基因編輯納米顆粒遞送系統(tǒng)的先進性，然而，眾多其他類型的納米載體同樣具備潛力，可巧妙地設計以進入細胞內(nèi)部。例如，聚合物納米顆粒、蛋白質衣殼遞送系統(tǒng)以及類病毒顆粒（VLP）等，均為這一領域的研究者提供了新的遞送策略。

在本文中，我們向您介紹了CRISPR/Cas系統(tǒng)的三種生物形式及遞送方法，這些基礎知識鋪墊了對CRISPR技術的理解，為我們了解其在廣泛領域應用奠定了基礎。請繼續(xù)關注我們的系列文章，在接下來的文章中，我們將帶您了解CRISPR/Cas技術在細胞基因治療、農(nóng)業(yè)等不同領域中的應用，更多精彩內(nèi)容，不容錯過，敬請期待！

參考文獻：

[1] Yi Lin, Ernst Wagner and Ulrich L?chelt, Non-viral delivery of the CRISPR/Cas system: DNA versus RNA versus RNP, Biomater. Sci., 2022, 10, 1166–1192

[2] Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-361.