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圖1.PBCV DNA Ligase反應(yīng)原理示意圖
PBCV DNA Ligase的連接活性遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)T4 DNA 連接酶，并對以 RNA 為夾板的 DNA 底物表現(xiàn)的出親和力（表觀 Km = 1 nM，Km值越小表示親和力越強），從而能夠?qū)?fù)雜混合物中的 RNA 種類進(jìn)行亞納摩爾級檢測。因此，該酶非常適合應(yīng)用于高靈敏度RNA檢測，包括各種SNP的miRNA、mRNA和非編碼RNA的定性或定量檢測，以及用于二代測序和分子診斷。接下來，小編給大家介紹下PBCV DNA Ligase的神奇應(yīng)用吧！
PBCV DNA Ligase應(yīng)用解析
原位測序
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠繪制出組織中特定轉(zhuǎn)錄本的位置，識別特定基因的表達(dá)位置，從而可以從分子層面更全面地研究組織，目前主要的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)包括：
如表所示，原位測序是一種在細(xì)胞或組織中直接進(jìn)行mRNA序列分析的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。該技術(shù)通過特制探針與目標(biāo)mRNA雜交，利用滾環(huán)擴增（RCA）在特定位置生成信號，接著用熒光染料標(biāo)記來識別具體序列，已實現(xiàn)保留基因表達(dá)的空間信息的目的。今天，小編主要以Mip-seq為例，介紹下PBCV DNA Ligase在原位測序中的應(yīng)用。Mip-Seq技術(shù)通過PBCV DNA Ligase連接構(gòu)建RCA模板，接著RCA擴增以放大信號，并結(jié)合多輪測序以實現(xiàn)高通量檢測，能夠以亞細(xì)胞分辨率有效解析DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小分子等多種生物分子，可用于檢測腫瘤基因突變和親本基因的等位基因特異性表達(dá)，從而實現(xiàn)精確的腫瘤診斷。
MiP-Seq技術(shù)路線如下：
掛鎖探針雜交
使用特定的掛鎖探針（padlock probes）與目標(biāo)RNA相結(jié)合，這些探針帶有RCA啟動子引物探針，用于目標(biāo)依賴的RCA。
原位滾環(huán)擴增（RCA）
使用PBCV DNA Ligase（圖示SplintR連接酶）將掛鎖探針連接成環(huán)狀，形成RCA模板，在Phi29聚合酶的作用下進(jìn)行原位滾環(huán)擴增。
數(shù)據(jù)分析
對原位滾動擴增產(chǎn)物（RCP）進(jìn)行多輪測序，并通過連接和信號解碼來解讀數(shù)據(jù)。
圖2. Mip-seq原理圖[1]
高靈敏核酸檢測
分子檢測，特別是核酸檢測，因其快速、靈敏和精準(zhǔn)而受到青睞，但無論是標(biāo)準(zhǔn)qPCR技術(shù)還是等溫擴增技術(shù)都需要一定的實驗設(shè)備，限制了病原體檢測的普及性應(yīng)用。為此，張鋒名下的診斷公司Sherlock Bioscience開發(fā)了一款無需儀器、可在環(huán)境溫度下實現(xiàn)精確且多重核酸檢測的INSPECTR核酸檢測技術(shù)[2]，其應(yīng)用不僅局限于傳染病診斷，還擴展到檢測抗微生物肽、單核苷酸多態(tài)性等方面。
INSPECTR核酸檢測技術(shù)原理如下：
連接單鏈DNA
單鏈DNA探針經(jīng)過設(shè)計，在特定靶向RNA上具備同源性，當(dāng)RNA“扣夾"三元分子結(jié)構(gòu)時，PBCV DNA Ligase（圖示SplintR ligase）進(jìn)行單鏈DNA的連接。
擴增雙鏈線性產(chǎn)物
DNA聚合酶合成連接后的ssDNA探針的互補鏈，從而產(chǎn)生了編碼報告蛋白的雙鏈DNA（dsDNA）表達(dá)盒。
產(chǎn)生報告產(chǎn)物
向表達(dá)盒添加含有核糖體、T7 RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子、氨基酸、核苷酸及其他輔因子的無細(xì)胞表達(dá)（CFE）系統(tǒng)后，產(chǎn)生可通過視覺或電子裝置檢測到的報告蛋白。
圖2. NSPECTR原理圖原理圖[2]
除了上述應(yīng)用，PBCV DNA Ligase也被應(yīng)用于EXTRA-CRISPR技術(shù)[3]（Cas12介導(dǎo)的高靈敏度miRNA檢測）以及SELECT技術(shù)[4]（基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增方法）等。在EXTRA-CRISPR技術(shù)中，該酶通過連接形成RCA模板，為隨后的RCA擴增和信號增強提供了基礎(chǔ)，顯著提升了Cas12系統(tǒng)對miRNA的檢測敏感性。而SELECT方法則是借助m6A修飾可阻止PBCV DNA Ligase連接兩個寡核苷酸的特性，在經(jīng)過幾輪m6A選擇后，含m6A的RNA模板產(chǎn)生的連接產(chǎn)物顯著少于未修飾的RNA模板，接著通過qPCR可進(jìn)行精確定量分析。這些應(yīng)用實例充分展示了PBCV DNA Ligase在原位測序、RNA檢測等方面的廣闊應(yīng)用前景。
翌圣PBCV DNA Ligase
翌圣團(tuán)隊潛心研發(fā)，通過翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor™酶進(jìn)化平臺（了解更多），成功推出PBCV DNA Ligase（Cat#14962）。翌圣PBCV DNA Ligase來源于Chorella virus，其蛋白純度＞95%，無核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留，特別適用于原位測序、高靈敏核酸檢測等應(yīng)用場景。
部分?jǐn)?shù)據(jù)展示
無核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留
將3個批次的翌圣PBCV DNA Ligase (Cat#14962ES)與底物DNA在37℃孵育4 h（125 U 投入量），以及與底物RNA在37℃孵育16 h（25 U 投入量）。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，翌圣PBCV DNA Ligase無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。同時，利用磷酸酶檢測盒對3個批次的PBCV DNA Ligase進(jìn)行檢測，4 h反應(yīng)后，酶活(µmol/min)數(shù)據(jù)顯示翌圣PBCV DNA Ligase磷酸酶殘留極低（<0.0001）。
圖3. 核酸外切酶、內(nèi)切酶、RNase、磷酸酶殘留檢測
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產(chǎn)品應(yīng)用 | 產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 |
原位測序 | 5'端磷酸化墊鎖探針 | T4 Polynucleotide Kinase | 12902ES、14501ES |
墊鎖探針連接（形成RCA模板） | PBCV DNA Ligase | 14962ES | |
RCA擴增（目標(biāo)DNA放大） | phi29 DNA Polymerase (10 U/μL) | 14404ES | |
多輪測序連接 | T4 DNA連接酶 | 10298ES | |
成像（以防止RNA在成像過程中發(fā)生降解） | Murine RNase Inhibitor | 10610ES、14671ES | |
高靈敏核酸檢測 | / | T7 RNA Polymerase(250 U/μL) | 10626ES |
