聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
通常我們做完熒光定量PCR后，會通過下機數(shù)據(jù)來分析基因表達情況。這篇干貨將會給大家詳細分享熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法，希望能給小伙伴們一定的幫助。
相對定量法中常見的是比較Ct法，其中主要包括△△Ct法，Pfaffl法和△CT法，目前諸多科研人員采用最多的是△△Ct法。雖然該方法應(yīng)用廣泛，但是很多人卻不了解其中的原理。知其然，知其所以然。小翌接下來給小伙伴們講一下△△Ct法的原理。
△△Ct法原理
Ct值：每個反應(yīng)管中熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所需要的循環(huán)數(shù)。起始模板拷貝數(shù)越多， Ct值則越小。
理論條件下，DNA擴增是以半保留復制的形式每個循環(huán)增加一倍，由100條變200條，由200條變400條，由400條變800條等等，用數(shù)學表達式來說就是2^Ct。但是實際情況中，擴增效率不是100%的，增量的表達形式則變成了(1+e)^Ct，其中e表示的是擴增效率。
擴增產(chǎn)量=起始模板量×(1+e)^Ct
由于不同反應(yīng)條件下，e值不一樣，為便捷地計算，分析數(shù)據(jù)時將e默認為100%，那么擴增產(chǎn)量=起始模板量×2^Ct。
看到這，有小伙伴可能會想，在一樣的產(chǎn)物量(熒光信號水平)下，比較Ct值，那我就可以比較不同實驗組的起始模板量，是不是就可以得出基因表達差異的結(jié)果了。然而事實并非如此，不同實驗組難以保證上樣量的一致性、生物本身的一致性、整體操作誤差的一致性，做出來的結(jié)果是有偏差的，甚至可能是相反的。這里給小伙伴們舉個例子。
測試一款減少黑色素表達的藥物，該藥物以灌胃的形式給藥至實驗組小鼠，對照組小鼠僅以正常飲用水進行灌胃，以往大量研究已表明該藥物對于黑色素表達有明顯的抑制作用。
如果研究目的基因，簡單僅以兩組的目的基因表達量相比，可以發(fā)現(xiàn)，實驗組生成黑色素的基因表達量相比于對照組要多四倍。
然而已有大量研究證明該藥物抑制黑色素表達，計算結(jié)果與已有理論存在相悖的情況(也有可能是發(fā)現(xiàn)了新課題o(*￣▽￣*)ブ)。為什么會出現(xiàn)這個結(jié)果呢？其原因可能主要是兩組小鼠RNA提取的時候處于不同的時間、提取樣本量不一樣、cDNA上樣量不一樣、cDNA濃度不一樣等等。
為避免各類潛在差異帶來的影響，需引入內(nèi)參基因，可見上圖右半部分。內(nèi)參基因通常是一種始終保持著低水平甲基化且一致處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因，高度保守且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達，其表達水平受環(huán)境因素影響較小。通常在檢測基因的表達水平時用作參照物，可用以校正操作、上樣量差異等帶來的實驗誤差，從而保證結(jié)果的準確性。
同樣樣本，在原測試目的基因的基礎(chǔ)上，加測內(nèi)參基因。對照組得到的目的基因與內(nèi)參基因之間的模板比值為正常老鼠目的基因的比例關(guān)系，理論狀態(tài)下，以該比例×實驗組老鼠恒定表達的內(nèi)參基因表達量即可獲得實驗組老鼠在正常狀態(tài)下目的基因的理論表達量，實際實驗組老鼠目的基因表達量除以理論表達值，即可計算出老鼠在藥物處理下，目的基因的表達量變化情況，具體如下：
以上結(jié)果可以得出，實驗組目的基因表達量僅為對照組的1/2，也符合以往研究報道。
是不是小伙伴們以為△△Ct法原理的描述到這里就結(jié)束了？不不不，我們上文中有提到實際情況中擴增產(chǎn)量=起始模板量×(1+e)^Ct，為便捷計算，分析數(shù)據(jù)時將擴增效率e默認為100%，那么擴增產(chǎn)量=起始模板量×2^Ct。我們在實際做實驗的時候，也要注意內(nèi)參基因和目的基因所對應(yīng)的擴增效率控制在接近100%或者基本一致，否則△△Ct法得出的結(jié)果和實際情況會有出入。
如上表格，若內(nèi)參基因和目的基因擴增效率上未控制在基本一致或接近100%，則在使用△△Ct法上會有一定的偏差風險。
數(shù)據(jù)處理案例解析
假設(shè)目前需要研究甲藥物對小鼠X基因表達的影響，以未經(jīng)過任何處理的小鼠作為對照組，實驗組為經(jīng)過不同量藥物處理過的小鼠，分別提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，選擇小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參，進行qPCR實驗。
上機設(shè)置的qPCR孔如下
圖示說明：
1）NTC：以水代替模板，用來驗證PCR體系中是否存在污染，每一對引物都需要做NTC；
2）NRC：是指用未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，是對gDNA殘留的控制，每一個樣本都需要做NRC；
3）生物學重復：不同的樣本（ABC）；
4）技術(shù)重復：實際上就是同一材料包括的復孔（123）。
下機處理的Excel數(shù)據(jù)如下
圖示說明：
1）0mg：未經(jīng)過任何處理的小鼠-對照組；
2）④：對照組校正后的數(shù)值；
3）③/④：每個小組校正后的數(shù)值比上對照組校正后的數(shù)值；
4）注意圖表上的數(shù)據(jù)在excel中采用了保留2位小數(shù)的形式，實際計算時不可忽略小數(shù)點后的所有數(shù)字，減少按數(shù)字的動作，活用Excel。
GraphPad中進行繪圖分析
種草推薦
目前翌圣qPCR mix系列的產(chǎn)品已經(jīng)榮登Nature、 Cell等多個頂級期刊，獲得科研大牛們認可！以下僅展示部分助力發(fā)表的高分文章：
[1] Li Y, Wang D, Ping X, et al. Local hyperthermia therapy induces browning of white fat and treats obesity. Cell. 2022;185(6):949-966.e19.doi:10.1016/j.cell.2022.02.004.(IF=66.850)
[2] Seki T, Yang Y, Sun X, et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 2022;608(7922):421-428. doi:10.1038/s41586-022-05030-3. (IF=69.504)
[3] Chen P, Wang W, Liu R, et al. Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1. Nature. 2022;606(7914):550-556. doi:10.1038/s41586-022-04719-9.(IF=69.504)
[4] Dong W, Zhu Y, Chang H, et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature. 2021;589(7843):586-590. doi:10.1038/s41586-020-3016-z.(IF=69.504)
[5] Lu XY, Shi XJ, Hu A, et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1-USP20-HMGCR axis. Nature. 2020;588(7838):479-484. doi:10.1038/s41586-020-2928-y.(IF=69.504)
[6] Bi X, Wang K, Yang L, et al. Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes. Cell. 2021;184(5):1377-1391.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.046.(IF=66.850)
[7] Liu S, Hua Y, Wang J, et al. RNA polymerase III is required for the repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination. Cell. 2021;184(5):1314-1329.e10. doi:10.1016/j.cell.2021.01.048.(IF=66.850)
[8] Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019;177(4):865-880.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.03.046.(IF=66.850)
[9] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell. 2018;172(5):1091-1107.e17. doi:10.1016/j.cell.2018.02.001.(IF=66.850)
[10] Chai Q, Yu S, Zhong Y, et al. A bacterial phospholipid phosphatase inhibits host pyroptosis by hijacking ubiquitin. Science. 2022;378(6616):eabq0132. doi:10.1126/science.abq0132.(IF=63.714)
[11] Yu Q, Liu S, Yu L, et al. RNA demethylation increases the yield and biomass of rice and potato plants in field trials. Nat Biotechnol. 2021;39(12):1581-1588. doi:10.1038/s41587-021-00982-9.(IF=68.164)
[12] Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regulates blood cholesterol levels in humans and mice. Cell Res. 2020;30(4):363-365. doi:10.1038/s41422-020-0303-z.(IF=46.297)
[13] Wang Z, Lu Z, Lin S, et al. Leucine-tRNA-synthase-2-expressing B cells contribute to colorectal cancer immunoevasion. Immunity. 2022;55(6):1067-1081.e8. doi:10.1016/j.immuni.2022.04.017.(IF=43.474)
[14] Bi Q, Wang C, Cheng G, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022;55(8):1466-1482.e9. doi:10.1016/j.immuni.2022.06.018.(IF=43.474)
[15] Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile Temperature Critically Controls the Differentiation and Pathogenicity of T Helper 17 Cells. Immunity. 2020;52(2):328-341.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.01.006.(IF=43.474)
[16] Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection. Immunity. 2020;52(1):109-122.e6. doi:10.1016/j.immuni.2019.11.015.(IF=43.474)
[17] Zhang X, Zhang C, Qiao M, et al. Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells. Cancer Cell. 2022;40(11):1407-1422.e7. doi:10.1016/j.ccell.2022.09.013.(IF=38.585)
[18] Wang XY, Wei Y, Hu B, et al. c-Myc-driven glycolysis polarizes functional regulatory B cells that trigger pathogenic inflammatory responses. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):105. Published 2022 Apr 18. doi:10.1038/s41392-022-00948-6.(IF=38.104)
[19] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):275. Published 2020 Nov 24. doi:10.1038/s41392-020-00408-z.(IF=38.104)
[20] Ren Y, Wang A, Wu D, et al. Dual inhibition of innate immunity and apoptosis by human cytomegalovirus protein UL37x1 enables efficient virus replication. Nat Microbiol. 2022;7(7):1041-1053. doi:10.1038/s41564-022-01136-6.(IF=30.964)
<上下滑動查看更多>
翌圣生物基因研究完整解決方案
產(chǎn)品特別推薦
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
免氯仿升級版 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent(Tcm Free) | 19202ES | |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min一步gDNA去除&反轉(zhuǎn)錄預混液(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR | 11151ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149/11150ES | |
鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
qPCR染料法 | 高特異高熒光值定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix | 11185ES |
高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES | |
定量預混液 (染料法)，已發(fā)文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES |
