聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機(jī)：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號(hào)3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
背 景
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫，中文全稱為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞"。CIK細(xì)胞來源于CD3+CD56-T細(xì)胞, 是激活的Ⅱ型T淋巴細(xì)胞且同時(shí)兼具NK細(xì)胞的殺傷特性。但CIK細(xì)胞在外周血中含量甚微(約1%-5%)。因此要將CIK細(xì)胞用于臨床治療, 首先必須進(jìn)行大量擴(kuò)增。CIK細(xì)胞的產(chǎn)生過程大致如下：利用密度梯度離心法將患者或健康人外周血中單核細(xì)胞分離出來后, 通過添加外源性細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-1、CD3單抗進(jìn)行體外誘導(dǎo)擴(kuò)增。體外擴(kuò)增2周-4周后, 培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量具有強(qiáng)抗癌活性的異質(zhì)細(xì)胞群, 即為CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)。該細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的辨認(rèn)能力非常強(qiáng)，好像 “ 細(xì)胞 " ，能 “ 點(diǎn)射 " 腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及 “ 無辜 " 的正常細(xì)胞。因而，CIK 細(xì)胞治療是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。
圖1.CIK細(xì)胞制備流程[1]
CIK培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體
白細(xì)胞介素-2 (IL-2 )
IL-2是引起T細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子。IL-2通過其受體共用鏈IL-2Rβ鏈和γ鏈, 經(jīng)Jak/Stat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞增殖, 同時(shí)促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞定向分化為效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。
干擾素-gama (IFN-γ )
FN-γ對(duì)提高細(xì)胞毒活性非常重要, 不同的添加順序與細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。將IFN-γ添加在IL-2之前可以明顯提高細(xì)胞毒活性, 其機(jī)制在于IFN-γ可以誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2受體(IL-2R)的高表，從而會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。
白細(xì)胞介素-1a（IL-1a）
IL-1a也可以提高外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R的表達(dá)。當(dāng)IL-1a與IFN-g和激發(fā)型CD3單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK 的細(xì)胞毒作用。
CD3激發(fā)型單抗
T細(xì)胞活化的第一信號(hào)來自于T細(xì)胞表面的受體，即T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別。CD3分子在T細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細(xì)胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使T細(xì)胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識(shí)別和激活過程，從而引起T細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK細(xì)胞培養(yǎng)中的刺激因素。
此外，CD3激發(fā)型單抗需要注意克隆號(hào)。克隆號(hào)為OKT3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK培養(yǎng)時(shí)，最好選用OKT3克隆。
細(xì)胞制備
外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集
用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞50-100mL；
淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；
無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
CIK細(xì)胞的培養(yǎng)
將PBMC按1-2 x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
24h后加入50ng/ml的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細(xì)胞的生長和增殖；此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml的重組人IL-1a；
每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；
在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細(xì)胞。
CIK細(xì)胞質(zhì)控
臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)胞的比例應(yīng)在20%以上；
細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 104個(gè)，終體積為200 ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。
收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素。
推薦試劑
應(yīng)用 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
CIK細(xì)胞培養(yǎng) | Human IL-2 | 90103ES | 10μg/100μg |
Human IFN-gama | 91207ES | 20μg/50μg/100μg | |
Human IL-1α | 90100ES | 2μg/10μg/50μg | |
CIK細(xì)胞質(zhì)控 | 臺(tái)盼藍(lán)染色法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒 | 40208ES | 100T/500T |
內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒 | 60401ES06 | 17T | |
一步法快速支原體檢測(cè)試劑盒 | 40612ES | 25T/100T | |
乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 | 40209ES76 | 500 T |
參考文獻(xiàn)
[1] Jingting Jiang, Changping Wu &Binfeng Lu .Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J]. Journal of Translational Medicine volume 11, Article number: 83 (2013) .
