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支原體概念和污染的影響
支原體（Mycoplasma）又稱霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、無細胞壁的原核生物，直徑大小0.1~0.3μm，能通過濾膜且呈高度多形性，是哺乳動物細胞培養(yǎng)中相對常見且難以檢測的細菌污染物。
支原體污染對細胞培養(yǎng)造成多方面的不良影響，已經(jīng)成為在細胞培養(yǎng)時的一個嚴重問題，保守估計常規(guī)細胞培養(yǎng)中支原體污染率為15~35%，嚴重干擾實驗結果的可信度。
細胞培養(yǎng)中95%的支原體污染主要是由萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體、口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、豬鼻支原體引起的。支原體在培養(yǎng)基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀。細胞培養(yǎng)上清和細胞膜適宜支原體生長，寄生在細胞表面的支原體可以穿透宿主細胞膜。
支原體污染來源主要有：細胞培養(yǎng)液或其成分（如培養(yǎng)基原料、血清和其他試劑）、實驗室操作人員、細胞培養(yǎng)箱、液氮培養(yǎng)箱、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過度使用、密封不當?shù)募毎囵B(yǎng)物和污染了支原體的細胞等。
與此同時，這些污染對應的危害為：導致細胞制品或以細胞為介質進行生產(chǎn)的產(chǎn)品在下游純化過程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報廢、污染其接觸的所有相關設備設施甚至中間或終產(chǎn)品、導致其他正常細胞受到支原體污染、導致重要細胞或病毒種子庫受到支原體污染而報廢、導致實驗室整體環(huán)境受到污染而被迫停止生產(chǎn)或實驗操作進行支原體去除、導致支原體產(chǎn)生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴大、對實驗室中的其他細胞培養(yǎng)物造成威脅。
因此，定期進行支原體檢測和去除，確保無支原體存在細胞培養(yǎng)體系內(nèi)才能保障科學研究工作的正常進行。
支原體檢測
支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染"。
2020年版中國藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質制備及質量控制》中提出對于生產(chǎn)用細胞，需要對主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）、生產(chǎn)終末細胞（EOPC）進行支原體檢查。
FDA, Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。
ICH Q5D《用于生產(chǎn)生物技術/生物產(chǎn)品的細胞底物的起源和特征描述》也提到：對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。
圖1.中外法規(guī)里要求的支原體污染檢測點
傳統(tǒng)的支原體檢測方法主要為培養(yǎng)法和指示細胞法，但由于這兩種方法的檢測周期長或靈敏度問題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長。而隨著細胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對支原體檢測時效性和靈敏度要求越來越高，短的貨架期不足以支撐如此長的檢測周期，因此快檢的NAT方法從眾多支原體檢測方法中脫穎而出。
圖2.中外法規(guī)里列舉的支原體檢測方法
基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴增技術，翌圣生物開發(fā)了一系列支原體快速檢測的試劑盒，其中包括熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒、一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒和巢式PCR法支原體檢測試劑盒。
熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒
是一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品，即主要用于生物醫(yī)藥領域的藥物研發(fā)、生產(chǎn)、放行等方面。
產(chǎn)品資質
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗證，符合國際機構的標準；
配合審計：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質量體系標準，有完善的審計文件；
保障品質：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
技術經(jīng)驗積累：TaqMan法有技術沉淀，Kit靈敏度可達10CFU/mL及以下；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
產(chǎn)品特點
檢測種類多：優(yōu)化的TaqMan探針可檢測多達183種支原體；
操作簡便：樣本制備和檢測總時長<3h，無需培養(yǎng)法的28天等待；
靈敏度高：檢測限達到可以替代直接培養(yǎng)法的10CFU/mL；
專屬性強：針對16s rRNA設計引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣關系物種交叉反應；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽性對照(PC)無感染性，消除污染風險；
防干擾強：引入內(nèi)部質控(IC)，可排除樣本干擾、反應配制異常等因素，有效避免假陰性。
圖3.熒光探針qPCR法支原體檢測工作流程
一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒
采用等溫擴增技術，在顏色判別方面具有更強的辨識度，由藍紫色（陰性）向天藍色（陽性）變，更利于肉眼的判別，增加了防污染組分，杜絕假陽性現(xiàn)象的存在。
圖4. 一步恒溫顯色法支原體檢測操作流程
巢式PCR法支原體檢測試劑盒
不同于普通的一步法PCR檢測方法，將原先的1對引物提高至3對引物，針對支原體16s和23s保守區(qū)進行巢式PCR擴增，在改變產(chǎn)品非特異性的同時大大提升了產(chǎn)品的靈敏度，可以檢測低至單個拷貝的支原體。
圖5.巢式PC法支原體檢測操作流程
支原體去除
在細胞培養(yǎng)過程中，定期檢測能夠有效的避免支原體大量污染，但如果細胞已受支原體污染，則需對其進行及時處理，最佳處理原則為將細胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細胞株。若受污染的細胞比較珍貴，必須去除支原體污染，可以通過混合使用抗生素以達到目的。由于支原體無細胞壁，因此傳統(tǒng)的抗生素一般對其無效。此時，選擇一款合適的支原體去除試劑尤為重要。
翌圣生物MycAway™ Treatment (1000×)支原體去除試劑，是一種混合抗生素制劑，含有三種對支原體具有抑菌作用的組分，分別是喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。該支原體去除試劑可通過抑制DNA和支原體生長所必須的相關蛋白合成來取得良好的支原體清除效果，且對細胞無傷害，挽救細胞，減少因支原體污染帶來的損失。
產(chǎn)品特點
毒性低：對細胞毒性小，不影響后續(xù)細胞實驗，如細胞轉染和活力檢測等；
穩(wěn)定性強：-20℃試劑能較長時間保存并保持高效用；
操作簡單：只需將產(chǎn)品添加至支原體污染的培養(yǎng)基中孵育即可；
起效快：最快3天即可見效；
去除范圍廣：能去除實驗室絕大多數(shù)支原體類型。
圖6.支原體去除試劑細胞毒性檢測圖示
支原體預防
在細胞培養(yǎng)過程中，支原體污染常有發(fā)生，但由于其特殊性很難被肉眼和顯微設備檢測到，因此做好支原體的預防工作顯得尤為重要?？赏ㄟ^向培養(yǎng)基中添加支原體預防試劑，來有效預防支原體的污染。
目前實驗室支原體主要來自于：細胞間的交叉污染、工作環(huán)境或者實驗器材的污染、實驗者無菌操作不佳、污染的培養(yǎng)基或者試劑、帶有支原體污染的原始組織或者器官等。翌圣生物開發(fā)的支原體預防系列產(chǎn)品，具有操作簡單、方便、穩(wěn)定性好等特點，非常適合日常細胞系培養(yǎng)中支原體預防。
產(chǎn)品信息
