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什么是樹突狀細胞（DC）？
DC細胞是“Dendritic Cell"，中文名稱是樹突狀細胞。樹突狀細胞是人體內(nèi)有效的抗原遞呈細胞（antigen presenting cell, APC）。DC細胞是能夠顯著刺激初始T細胞增值的APC，其他種類的APC（如單核巨噬細胞，B細胞等）僅能刺激已活化的或者記憶性的T細胞，因此DC細胞是適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著及其重要的作用。DC 表面高表達MHC -I和MHC -II類分子，具有特異性表面標志的細胞。其對抗原攝取，加工以及刺激T細胞使其激活，并最終決定T細胞的分化方向。
DC的來源
DC細胞在體內(nèi)含量甚微, 從體內(nèi)直接分離出DC耗時而且細胞產(chǎn)量很低，這極大地限制了DC的研究和應(yīng)用。但DC能從不同組織里的DC前體細胞分化、誘導(dǎo)而來, 如骨髓液的前體細胞，外周血和臍帶血的單核細胞。
對于人，由于人外周血的取材最為方便且單核細胞數(shù)量最多，所以常用的方法是從人外周血單個核細胞(PBMC)誘導(dǎo)DC。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DC，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
圖1.經(jīng)典的 BMDC 制備方法簡圖
BMDC制備方法
常見的小鼠BMDC制備方法有：
BMDC的大量制備法—Lutz法。
經(jīng)典的BMDC培養(yǎng)法-Inaba法（改良）
背景
1. Inaba法獲得的BMDC 數(shù)目為5-7 x 106個/小鼠；
2. Inaba原法僅用GM-CSF來誘導(dǎo)BMDC的產(chǎn)生，雖然得到的BMDC在混合淋巴細胞反應(yīng)中有較強的刺激能力，但DC的成熟度不及GM-CSF+IL-4的聯(lián)合誘導(dǎo)，所以后來的改良法中多用GM-CSF+IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)。
培養(yǎng)步驟
1. 小鼠骨髓細胞的獲得
1.1 小鼠(6-10周齡)頸椎脫臼法處死，手術(shù)取出所有股骨和脛骨，并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈；【注】：不要損傷到骨。
1.2 將骨移至超凈臺內(nèi)，并用盛有70%酒精的無菌培養(yǎng)皿浸泡2-5min，以消毒滅菌，然后用無菌的PBS洗2次；
1.3 將骨移入另一個盛有PBS 的新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨變白；
1.4 收集骨髓懸液，用200目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織；
1.5 過濾液1200rpm 離心5min，棄上清；
1.6 加入2 ml氯化銨紅細胞裂解液(1x)，重懸細胞，室溫孵育3-5min，最長10min；
1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 離心5min，棄上清;
1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，至此已獲得小鼠骨髓細胞。
氯化銨紅細胞裂解液的配制：
1）先配制10x的貯存液，配法如下：稱取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸餾水中，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃儲存6個月；
2）臨用前，將10x貯存液用無菌蒸餾水1 : 9稀釋成1x工作液即可。
【注】：因氯化銨紅細胞裂解液對骨髓細胞有一定的傷害作用，所以要盡量縮短溶血時間。
2. BMDC 的誘導(dǎo)分化
2.1 步驟1中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為0.5-1x 106/ml；
2.2 鋪至24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，此為培養(yǎng)的第0天；
【注】：
1) 一般一只小鼠大約可收獲4-5x107個骨髓細胞，所以可以鋪至少40-50個24 孔板板孔。
2)GM-CSF 和IL-4 的使用濃度區(qū)間分別為20-50ng/ml 和10-40ng/ml。
2.3 每2天輕輕搖晃培養(yǎng)板，然后3/4 體積更換新鮮培養(yǎng)液，并補足細胞因子。
2.4 在第5天和第8天之間，輕柔吹打培養(yǎng)液，收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞；
2.5 1200rpm離心5min，棄上清；
2.6 用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，并加入重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)；
2.7 細胞鋪板至100mm培養(yǎng)皿(每皿最多10ml)或6孔培養(yǎng)板(2m/孔)。
2.8 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2天；
2.9 收集懸浮細胞，即為較成熟的BMDC。
【注】：
1）第2.5-2.8步為再鋪板步驟，目的是使第2.4步獲得的BMDC更加成熟。
2）再鋪板后的3h內(nèi)可見許多棘狀貼壁細胞從DC簇中遷移出來，而培養(yǎng)1天后會發(fā)現(xiàn)這些貼壁細胞從培養(yǎng)板底脫離，而且可以看見在培養(yǎng)液中漂浮著許多典型的DC。
3. BMDC的成熟
【注】：
步驟2中獲得的BMDC并非成熟的DC，若想得到成熟的DC，還需LPS，CD40L 或TNF-a 等的誘導(dǎo)。
3.1 步驟2.4 或2.9 中獲得的BMDC以1200rpm離心5min，棄上清；
3.2 用含重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；
3.3 加入24 孔培養(yǎng)板中，并加入成熟誘導(dǎo)劑，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等；
3.4 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天；
3.5 收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞即為成熟樹突狀細胞。
背景
1. 該法可在7天內(nèi)獲得30-40×106個DC/小鼠，是Inaba 經(jīng)典方法的7-10 倍。DC經(jīng)14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度離心后，純度(即CD11c+/I-Ab+細胞)可達85-95%。
2. 該法獲得的DC 的內(nèi)吞能力弱于Inaba 經(jīng)典方法，但分泌的IL-12p70 量相似；
3. 該法獲得的DC 在混合淋巴細胞反應(yīng)中比Inaba 經(jīng)典方法呈現(xiàn)更強的刺激能力；
4. 該法獲得的DC 能引起更強的特異性T 細胞反應(yīng)；
5. 綜上，Son法比經(jīng)典方法能獲得更多、更成熟的BMDC。
培養(yǎng)步驟
1. 小鼠骨髓細胞的獲得
見Inaba 法(改良)中的相應(yīng)步驟。
2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2× 105 /ml；
2.2 鋪至6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔5ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
2.3 在培養(yǎng)的第4天，向培養(yǎng)體系中補充重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)；
2.4 培養(yǎng)的第7天收集DC，用2-4ml RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，加至等體積的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200xg 室溫離心20min；
【注】
此時的DC 為不成熟的BMDC，要想進一步成熟，請?zhí)敛襟E3。
2.5 收集中間層，并用RPMI 1640培養(yǎng)液洗3次備用。
3. BMDC 的成熟
3.1 步驟 2.4 中收集的BMDC，重新鋪板，并向培養(yǎng)體系中加入重組小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，以及LPS (1-10μg/ml)
3.2 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，獲得成熟的BMDC。
BMDC大量制備法-Lutz 法
背景
1. Lutz法與Son法相似，均可大量制備BMDC，但與Son法相比，Lutz 法更為廣泛地被采用。
2. 該法可獲得更多的BMDC，達1-3 x 108個DC/小鼠，而且純度可達90-95%；
3. 該法比Son 法使用的細胞因子濃度低得多，僅為200U/ml，而且培養(yǎng)的第8天到第10天降為30-100U/ml，這樣可以大幅節(jié)約試劑成本；
4. 該法與Inaba 經(jīng)典方法和Son法的最大不同是使用細菌培養(yǎng)皿(Petri dish)而非細胞培養(yǎng)板來培養(yǎng)骨髓細胞。Inaba的解釋是細菌培養(yǎng)皿不容易使骨髓中的巨噬細胞貼壁，從而抑制巨噬細胞的發(fā)育，進而避免巨噬細胞對DC 成熟的抑制作用，這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量BMDC的主要原因。
5. 但該法的培養(yǎng)時間較長，需要10-12天，一方面是為了獲得更多的BMDC，另一方面，大多數(shù)粒細胞和淋巴細胞很難存活這么長時間，因此可提高最終獲得的BMDC 的純度；
6. 該法僅用GM-CSF 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若要進一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再誘導(dǎo)1-2天，其中成熟DC細胞的含量將達到50-70%。
培養(yǎng)步驟
1. 小鼠骨髓細胞的獲得
見Inaba 法(改良)中的相應(yīng)步驟，注意省去溶血步驟。
2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×105/ml；
2.2 鋪至100mm 細菌培養(yǎng)皿(Petri Dish)中，每皿10ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (200U/ml)，37℃， 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
【注】：
此處使用的是細菌培養(yǎng)皿，而非細胞培養(yǎng)板。
2.3 第3天時，向培養(yǎng)皿中再加入10ml 含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的培養(yǎng)液；
2.4 第6天和第8 天分別半量換液，即收集舊培養(yǎng)液，離心后用含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，然后再將細胞懸液放回原皿；
2.5 第10天時可收集細胞，即為BMDC。
3. BMDC 的成熟
3.1 培養(yǎng)第10天的DC用移液器輕輕吹打收集懸浮細胞，300xg 室溫離心5min；
3.2 棄上清，用10ml RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，然后鋪于100 mm 細胞培養(yǎng)板；
3.3 加入重組小鼠GM-CSF(100U/ml )和TNF-α(500U/ml)，或重組小鼠GM-CSF(100U/ml)和LPS (1μg/ml)；
3.4 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2天。
BMDC的鑒定
1. 形態(tài)學觀察：BMDC多數(shù)呈集落生長，細胞有多個樹突樣突起，成熟的BMDC 更加明顯；
2. 細胞表型分析：流式細胞術(shù)檢測DC 細胞表面CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 類分子(I-A/I-E)等的表達，BMDC高表達這些分子，成熟的BMDC中這些分子的表達會進一步提高。
3. 混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)：BMDC具有較強的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越強。
成熟誘導(dǎo)劑該如何選擇？
LPS，CD40L 和TNF-α無論對人DC 還是小鼠DC 均是常用、有效的成熟誘導(dǎo)劑。TNF-a 誘導(dǎo)DC 的成熟能力在三者中最弱。LPS 和CD40L 均是DC 體外成熟的強誘導(dǎo)劑，兩者誘導(dǎo)DC 的成熟度相似，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子譜有差異。CD40L誘導(dǎo)成熟的BMDC 在體內(nèi)顯示出的免疫調(diào)節(jié)能力，包括保護性和治療性腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。用LPS刺激DC成熟所用的濃度一般為1-10μg/ml，但其實0.1 μg/ml 已經(jīng)有非常強的作用，但保險起見，一般選用1μg/ml。對于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子屬于TNF 配體家族，該家族的特點是在形成三聚體后才能發(fā)揮作用。所以最好能用重組的CD40L三聚體蛋白來刺激DC，這樣會有很好的效果。如果用CD40L 單體來刺激DC，多數(shù)情況下成熟度并不是很高。
培養(yǎng)方法的選擇
表1.BMDC制備3種實驗方法對比
參數(shù) | Inaba法 | Son法 | Lutz法 |
在PubMed被引用次數(shù) | 783 | 24 | 663 |
骨髓溶血裂解紅細胞 | 是 | 是 | 否 |
骨髓先去除淋巴細胞 | 是 | 否 | 否 |
培養(yǎng)過程中去除粒細胞 | 是 | 否 | 否 |
骨髓細胞最初鋪板體積 | 1ml | 15ml | 10ml |
培養(yǎng)器 | 24孔細胞培養(yǎng)板 | 6孔細胞培養(yǎng)板 | 100mm細菌培養(yǎng)皿 |
培養(yǎng)液 | RPMI 1640+10% FCS | ||
小鼠GM-CSF濃度 | 200-1000U/mL | 開始為125-1000U/mL 第4天和第7天，向培養(yǎng)體系中再添加足量的GM-CSF和IL-4。 | 開始為200U/mL 第10天后3-100U/mL |
小鼠IL-4 | 不用 | 用，濃度同GM-CSF | 不用 |
換液方法 | 第2天和第4天吸棄50%-75%的舊培養(yǎng)液（其中含有細胞），然后換含足量GM-CSF的新鮮培養(yǎng)液 | / | 第3天補充等體積含GM-CSF的培養(yǎng)液，第6,8和10天半量換液，吸出的舊培養(yǎng)液（其中含細胞）離心后用含GM-CSF的新鮮培養(yǎng)液重懸后放回。 |
傳代前培養(yǎng)時間（擴增） | 6天 | 7天 | 10天 |
傳代后培養(yǎng)時間（成熟） | 2天 | 無 | 1-2天 |
成熟誘導(dǎo)劑 | TNF-ɑ（250U/mL） | LPS(1-10μg/mL) | TNF-ɑ（250U/mL）或LPS(1μg/mL) |
DC收獲時間 | 7-8天 | 7-8天 | 10-13天 |
DC純度 | 第8天：60-70% | 第7天：85-95% | 第10-12天：80-90% |
DC產(chǎn)量/小鼠 | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
DC培養(yǎng)試劑推薦
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Mouse GM-CSF | 91108ES | 5μg/50μg/100μg/500μg |
Mouse IL-4 | 90144ES | 5μg/50μg/100μg/500μg |
Mouse TNF-α | 90621ES | 5μg/20μg/50μg/500μg |
Mouse CD40L Trimer Protein | 94016ES | 25μg/100μg/500μg |
