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Th細胞概述
輔助性T細胞 (T helper cell, Th)由Na?ve CD4+ T細胞受到特定刺激（抗原、細胞因子）后分化而來。根據(jù)活化的 CD4+Th所分泌的細胞因子譜，分為 Th1、Th2、Th17、調節(jié)性T細胞(Treg)、Th9、Th22、Tfh細胞。每個亞群都由一組特定的細胞因子和轉錄因子活化，并以他們分泌的細胞因子和發(fā)揮的效應功能為特征。Th為免疫系統(tǒng)的其他細胞提供輔助功能，特別是抗原呈遞細胞（APCs），如巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞，并對這些細胞的活化和成熟起到重要的作用。
圖1.CD4+ T 細胞及其亞群[1]
Th1 細胞
Th1細胞的主要效應功能在于細胞免疫和炎癥，包括活化其他免疫細胞如巨噬細胞、B細胞和CD8+ 細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的細胞溶解和其他效應功能。此外，Th1細胞在活化CD8+細胞毒性T細胞、促進其靶向殺傷腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用。
Th1細胞表面標志物：CD3、CD4、CD28、CD44、CD45R、IFN-γR1以及CXCR3等。
Th1分泌的細胞因子：IFN-γ、TNFα、GM-CSF、IL-3、LT-α、LT-β、CXCR-3、CCL-2等。
表1.Th1細胞分泌的細胞因子及其功能
Th2 細胞
Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL17E等細胞因子，這些細胞因子能促進Th2細胞的增殖，進而輔助B細胞活化，從而促進B細胞的增殖、分化和抗體的生成，發(fā)揮體液免疫的作用。同時，這些細胞因子可抑制Th1細胞增殖。Th2細胞表面相對選擇性表達趨化因子受體 CCR3、CCR4、CCR8 和CRTh2。
Th17 細胞
Th17 細胞其特征性轉錄因子為 RORgt，可分泌 IL-17A、IL-17F、IL-21 和 IL-22，細胞表面高表達IL-23R和趨化因子受體CCR6、CCR4。微環(huán)境中TGF-β和IL-6可促使初始CD4+ T細胞分化為 Th17 細胞，并抑制其向 Th1和Th2細胞分化。IL-6/IL-6R 信號可激活 STAT3，啟動分化過程，并誘導 RORgt、IL-17 和 IL-23R 表達。IL-21和IL-23可促進Th17細胞分化并分泌IL-17和IL-22。
Th17細胞是最早參與抗感染免疫的效應性T細胞。機體感染李斯特菌、沙門菌、弓形蟲、隱球菌、利什曼原蟲等病原體后，DC 最早合成 IL-6和TGF-β，誘導初始T細胞分化為 Th17 細胞。Th17 細胞在抵御胞外細菌感染(尤其在與大量病原體直接接觸的腸道、呼吸道黏膜)發(fā)揮重要作用。
表2.Th17細胞體外培養(yǎng)試劑及功能
Th9 細胞
Th9 細胞因其可分泌大量IL-9而命名為Th9細胞。在微環(huán)境中TGF-β和IL-4共同作用下，可誘導初始T細胞分化為Th9細胞。另外，TGF-β也可單獨誘導Th2細胞分化為Th9細胞。Th9細胞也可分泌IL-10，但該亞群并無免疫抑制效應。
Th22 細胞
Th22 細胞參與某些慢性炎癥性疾病( 如牛皮癬、哮喘癥) 發(fā)生。該細胞分泌 IL-22、不分泌 IL-17和IFN-γ。該細胞可由記憶性T細胞(CD45RA- )分化而來，也可由pDC、IL-6和TNF誘導初始CD4+ T細胞分化而來。
Tfh 細胞
Tfh細胞表型為CD4+ CXCR5+ CCR7- ，并高表達共刺激分子 ICOS、PD1。Tfh 細胞的特征性轉錄阻抑蛋白為 BCL-6，可通過分泌 IL-21和IL-4等影響B(tài)細胞分化和抗體產生。淋巴結T細胞區(qū)的并指狀DC (interdigitating DC)表面 pMHC 與初始 CD4+ T細胞TCR高親和力結合，可啟動 CD4+T 細胞分化為Tfh 細胞。
調節(jié)性T細胞（Treg細胞）
該類細胞可對免疫應答進行精細的負調節(jié)，按其起源可分為天然型 Treg (natural Treg, nTreg)和誘導性 Treg 細胞(induced/inducible Treg, iTreg)。
nTreg表型特征為：CD4+ CD25+；表達 CTLA4、GITR等；不表達CD69(T細胞活化的表面標志)， 不表達或僅低表達 CD127(IL-7R)。該細胞是一類可發(fā)揮負調節(jié)作用的CD4+CD25+T 細胞亞群，nTreg可抑制CD4+T、CD8+ T細胞增殖和分泌細胞因子，并抑制 DC和單核細胞功能。
iTreg由在IL-2和TGFβ存在下，用抗CD3刺激naive CD4+T細胞。
人輔助性T細胞亞群分化方案
配置培養(yǎng)基試劑準備
1640培養(yǎng)基、血清（胎牛）、雙抗、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇。
培養(yǎng)基配置
RPM-1640+10%胎牛血清+1mML-谷氨酰胺+55μM β-巰基乙醇+雙抗。
細胞準備
分選出Naive CD4+ T cells(CD4+ CD25- CD44lowCD62Lhigh)
細胞刺激培養(yǎng)
包板濃度 2μg/ml（96孔板加50μl，48孔板加200μl）；
加入上述體積后4℃過夜包被，包被后棄去孔內液體，PBS洗板2次。
a) 96 孔板加入 1×105 細胞（200μl培養(yǎng)體系）
b) 48 孔板加入 2×105 細胞（500μl培養(yǎng)體系）
配置分化培養(yǎng)基
4μg/ml anti-Human CD28 + 10ng/ml Human IL-2
根據(jù)需要分化的方向額外添加以下成分：
1) Th1細胞: IL-12 (50 ng/mL) + anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
2) Th2細胞: IL-4 (50 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL)；
3) Th17細胞: IL-6 (50 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
4) iTreg細胞: TGF-β1 (10 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
5) Th9細胞: IL-4 (50 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL),+ anti-human IFN-γ (10 µg/mL)；
6) Th22細胞: IL-6 (50ng/mL), IL-23 (50ng/mL), + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
7) Tfh細胞: IL-6 (50ng/mL), IL-21 (10ng/mL), CXCL13 (10ng/mL)。
細胞培養(yǎng)分化
細胞培養(yǎng)分化3-5天，培養(yǎng)過程中若培養(yǎng)液上清變黃，更換培養(yǎng)基，一般建議半量換液，根據(jù)培養(yǎng)經(jīng)驗，一般是隔天換液。
培養(yǎng)分化后鑒定（胞內染色）
分化后的細胞加入20 ng/ml PMA , 1μg/ml Ionomycin 刺激30 min 后，加入10 μg/ml BFA 阻斷，繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h 后收集細胞進行流式檢測。
細胞鑒定
使用相應的流式抗體及輔助試劑進行胞內染色鑒定。
細胞分化所需細胞因子推薦
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Human IL-1β | 90101ES | 2μg/10μg/50μg/100μg |
Human IL-2 | 90213ES | 10μg/50μg/100μg |
Human IL-4 | 90105ES | 5μg/50μg/100μg/500μg |
Human IL-6 | 90107ES | 5μg/20μg/50μg/100μg |
Human IL-12 | 90111ES | 2μg/10μg/100μg/500μg |
Human IL-21 | 90215ES | 2μg/10μg/50μg/100μg |
Human IL-23 | 90198ES | 10μg/100μg |
Human CXCL13 | 90917ES | 5μg/100μg |
Human TGF-β1 | 91701ES | 2μg/10μg/100μg |
參考文獻：
[1] Amrita B,Ganesan R,Gabriella A, et.al. Differentiation and Regulation of TH Cells: A Balancing Act for Cancer Immunotherapy.Front. Immunol., 03 May 2021.
