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T4 DNA連接酶（T4 DNA Ligase）是一種由T4噬菌體編碼的酶，以ATP作為輔因子，催化雙鏈DNA或RNA的5’-磷酸與3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶既能催化黏性末端分子間或平末端分子間的連接，也能修復雙鏈DNA或DNA-RNA雜交雙鏈上的單鏈DNA切口，廣泛用于NGS測序，分子克隆等應用。然而，T4 DNA連接酶在實際應用中仍存在一些挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性差、接頭自連率高或DNA建庫產量低等問題。這些問題可能導致實驗效率的降低、數(shù)據(jù)質量的下降、實驗結果的重復性差以及產物純度低等，進而影響分子生物學實驗的整體效果和測序數(shù)據(jù)的準確性。為了解決這些問題，翌圣鎂孚泰生物基于ZymeEditorTM創(chuàng)新型酶進化平臺對T4 DNA連接酶進行了酶改造。
圖1.T4 DNA 連接酶反應原理
干濕實驗交互篩選
獲得高性能T4 DNA連接酶
T4 DNA連接酶的結構由緊密纏繞的DNA結合域（DBD）、核苷酸轉移酶（NTase）域以及OB折疊域構成。通過蛋白質結構分析，對DNA底物周圍5至20埃范圍內的氨基酸殘基進行了模擬篩選和結構-功能分析。分析結果揭示了T4 DNA連接酶中存在一個遠離活性中心的柔性環(huán)。接著，基于能量計算，設計了對這個環(huán)區(qū)域的截斷。同時，通過對齊共識序列，并結合結構與功能數(shù)據(jù)的綜合分析，精心設計突變體。
圖2.T4 DNA 連接酶
除了采用理性設計方法外，還通過微孔板篩選技術（MTPs）對T4 DNA連接酶進行了定向進化。篩選了超過10^4個突變體的庫后，成功獲得了具有更高穩(wěn)定性和更高活性的T4 DNA連接酶突變體。通過對大量突變體的數(shù)據(jù)分析，從中挑選出有潛力的候選突變體進行純化，并準備進行后續(xù)測試。所有通過理性設計和定向進化獲得的突變體，在經(jīng)過精細純化后，都進行了詳盡的表征分析。這包括對其活性、穩(wěn)定性、接頭自連接、DNA片段自連接以及DNA產量的評估，旨在開發(fā)出能夠滿足多樣化應用需求的高性能突變體。
數(shù)據(jù)展示
更高的熱穩(wěn)定性
熱穩(wěn)定性分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應商N≈供應商A >供應商T >供應商Q。
建庫產量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應商Q≈供應商T >供應商A >供應商N。
圖3.42℃熱穩(wěn)定性測試（Molefuture表示翌圣鎂孚泰的T4 DNA連接酶突變體，下同）
更高的建庫產量
1 µg gDNA投入量下的建庫產量分析：翌圣鎂孚泰生物>供應商Q≈供應商T≈供應商A >供應商N。
0.5 µg gDNA投入量下的建庫產量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應商Q≈供應商A≈供應商T >供應商N。
圖4.DNA建庫產量分析
更低的接頭自連
0 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：供應商N > 翌圣鎂孚泰生物 > 供應商T > 供應商A > 供應商Q。
0.5 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：翌圣鎂孚泰生物 > 供應商T > 供應商Q ≈ 供應商N > 供應商A。
圖5.投入0、0.5 ng gDNA的接頭自連數(shù)據(jù)
T4 DNA ligase突變體訂購指南
